Summary

Analys av proteinkinasaktivitet med radiomärkt ATP

Published: May 26, 2017
doi:

Summary

Proteinkinaser är högutvecklade signalerande enzymer och byggnadsställningar som är kritiska för inter- och intracellulär signaltransduktion. Vi presenterar ett protokoll för mätning av kinasaktivitet genom användning av radioaktivt märkt adenosintrifosfat ([γ-32P] ATP), en tillförlitlig metod som hjälper till att belysa cellsignalreglering.

Abstract

Proteinkinaser kan styra storskaliga cellförändringar som svar på komplexa stimuleringsstammar, och mycket ansträngning har gjorts för att avslöja allosteriska detaljer i deras reglering. Kinaser innefattar signaleringsnät vars defekter ofta är kännetecken för flera former av cancer och besläktade sjukdomar, vilket gör en analysplattform möjlig för manipulation av uppströms reglerande faktorer och validering av reaktionskrav som är kritiska i sökandet efter förbättrade terapeutiska medel. Här beskriver vi en grundläggande kinasassay som enkelt kan anpassas för att passa specifika experimentella frågor inklusive men inte begränsat till testning av effekterna av biokemiska och farmakologiska medel, genetiska manipuleringar såsom mutation och deletion såväl som cellodlingsförhållanden och behandlingar för att sondra Cellsignaleringsmekanismer. Denna analys utnyttjar radiomärkt [y-32P] ATP, vilket möjliggör kvantitativa jämförelser och tydlig visualisering av resultat och kan vara modIfied för användning med immunprecipiterat eller rekombinant kinas, specifika eller typifierade substrat, över ett brett spektrum av reaktionsbetingelser.

Introduction

Proteinkinaser är sofistikerade enzymer kritiska för överföring av cellulära signaler till lämpliga svar 1 . Med tanke på deras roller för att upprätthålla homeostas och förebyggande eller främjande av sjukdomstillstånd 2 fortsätter biokemiska metoder för att bedöma kinasaktivitet att vara kraftfulla verktyg för att avgränsa uppgifterna om eukaryotisk signalering 3 . Även om strategier som utnyttjar fosforspecifika antikroppar har varit mycket informativa när det gäller mätning av effekterna av olika behandlingsbetingelser på cellsignalstatus 4 möjliggör en kinasassay att mäta effekterna av olika behandlingsbetingelser direkt i termer av enzymatisk aktivitet hos en kinas av intressera. Även om det finns flera alternativ för liknande analyser som inte använder radioaktiva material 5 , fortsätter vi att förlita oss på denna metod för robust kvantifiering av resultat. därÄr två typiska tillämpningar av denna analys, båda värdefulla av olika skäl: den immunprecipiterade (IP) -kinasanalysen ( Figur 1 ) och den rekombinanta proteinkinasanalysen ( Figur 2 ).

IP-kinasassayen är oerhört användbar för att identifiera faktorer som kan aktivera specifika proteinkinaser såväl som mätningshämmande behandlingsbetingelser. I korthet transfekteras en epitopmärkt kinas av intresse i odlade eukaryota celler, utsätts för en mängd behandlingar, immunprecipiterade och analyseras för förmågan att införliva radiomärkt fosfat i ett modellsubstrat ( t.ex. myelinbaserat protein (MBP)). IP-kinasassay kan också utföras utan att tillgripa överuttryck, antingen genom immunutfällning av endogent protein eller något antal genom-redigeringstekniker. Eftersom behandlingar administreras i kultur kan denna metod detektera stimuleringar som överförs genom flera uppströmsfaktorerEller parallella vägar genom in vitro- avläsning. En stor fördel med denna metod är att den inte kräver förkunskaper om direkta uppströms eller nedströms faktorer eller fosforyleringsställen däri. Vidare, när specifika substrat för en intressant kinas av intresse har identifierats kan samma kinasassayprotokoll användas med rekombinanta komponenter för att mäta specifik aktivitet mot naturliga substrat och identifiera specifika fosforyleringsställen när de kombineras med masspektrometrianalys. Platser som identifieras på detta sätt kan valideras ytterligare med kinasassays med användning av substratmutanter. Slutligen kan denna metod också användas för att detektera och mäta autofosforylering.

Protokollet som tillhandahålls här förutsätter antingen ett optimerat proteinreningsschema eller transfektionsmetod för att uttrycka en affinitetsmärkad kinas av intresse i odlade celler. För mer detaljerade exponeringar av transfektion, lysis, immunutfällning och proteinreningsprotokollOcols, föreslår vi att vi hänvisar till Cold Spring Harbor Protocols 6 . För mer information om analysutveckling och modifiering hänvisas till Proteinfosforylering: Utvalda metoder i Enzymologi 7 .

Protocol

1. Kinasreningsresurser och allmän immunprecipitationsledning OBS: Kinaser för användning med denna analys kan erhållas från immunoprecipitater av odlade celler eller genom rekombinanta medel, såsom affinitetsmärkta rening 6 . Nedan finns ett allmänt protokoll för flagg-märkt immunutfällning som kan behöva modifieras beroende på kinas av intresse. Allt bör hållas på is när det är möjligt. Tillsätt 2 μl 1 mg / ml antikropp till 200 μl c…

Representative Results

WNK1 IP-kinasanalyser Myc-märkt WNK1 transfekterades in i HEK293-celler och immunopfälldes med en anti-Myc-antikropp 11 . Immunprecipitatet visade kinasaktivitet gentemot modellsubstratet MBP såväl som mot sig själv ( Figur 1A ). WNK1-mutanter testades sedan för kinasaktivitet mot MBP med samma metod, denna gång med användning av GST-märkta konstruktioner ( Figur IB</stron…

Discussion

Kinaser är en mångsidig familj av proteiner som har utvecklat en omfattande funktionalitet i många sammanhang och kinasanalyser har varit otroligt användbara vid studier av flera signalproteiner och har starkt bidragit till vår nuvarande förståelse av cellulär kommunikation. I synnerhet användes samma basanalys för att karakterisera två olika kinaser trots stora skillnader i struktur och aktivitet. WNK1-kinas innehåller en atypisk katalytisk ficka där den kritiska lysinen har förskjutits till en unik posit…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Författarna tackar alla nuvarande och tidigare medlemmar av Cobb-laboratoriet för värdefullt arbete och diskussioner, och Dionne Ware för administrativt bistånd. Dessa studier stöddes av National Institute of Health Grant R37 DK34128 och Welch Foundation Grant I1243 till MHC

Materials

Protein A Sepharose CL-4B GE Healthcare Life Sciences 17-0963-03
Radiolabeled [γ-32P] ATP Perkin Elmer NEG035C010MC
Laemmli Buffer Bio-Rad #1610737
Radioactive shielding Research Products International BR-006
R-250 dye (Coomassie) Thermo Fisher 20278
Whatman Grade 3 qualitative filter paper Whatman 1003-917
Slab gel vacuum dryer Bio-Rad Model 583 Gel Dryer #1651745 
Autorad marker Agilent Technologies 420201
Phosphorescent ruler Sigma Aldrich R8133
Phosphorescent dots Sigma Aldrich L5149
Geiger counter Ludlum Model 3 with 44-9 detector
BioMax Cassette 8×10" Carestream Health 107 2263
BioMax MS Film 8×10" Carestream Health 829 4985
BioMax MS Intensifying Screen 8×10" Carestream Health 851 8706
Medical/X-ray film processor Konica Minolta SRX-101A
Scintillation vials Research Products International 125500
Scintillation fluid MP Biomedicals 188245305
Beckman LS 6500 Scintillation counter Beckman LS 6500

References

  1. Raman, M., Chen, W., Cobb, M. H. Differential regulation and properties of MAPKs. Oncogene. 26 (22), 3100-3112 (2007).
  2. Wellbrock, C., Arozarena, I. The Complexity of the ERK/MAP-Kinase Pathway and the Treatment of Melanoma Skin Cancer. Front Cell Dev Biol. 4, 33 (2016).
  3. Yang, T., Terman, J. R. Characterizing PKA-Mediated Phosphorylation of Plexin Using Purified Proteins. Methods Mol Biol. 1493, 147-159 (2017).
  4. Ross, H., Armstrong, C. G., Cohen, P. A non-radioactive method for the assay of many serine/threonine-specific protein kinases. Biochem J. 366 (Pt 3), 977-981 (2002).
  5. Akita, S., Umezawa, N., Kato, N., Higuchi, T. Array-based fluorescence assay for serine/threonine kinases using specific chemical reaction. Bioorg Med Chem. 16 (16), 7788-7794 (2008).
  6. Dalby, K. N. Protein Phosphorylation: Selected Methods in Enzymology. J Am Chem Soc. 121 (51), 12215 (1999).
  7. . Autoradiography Available from: https://www.nationaldiagnostics.com/electrophoresis/article/autoradiography (2011)
  8. Walker, J. M. . The Protein Protocols Handbook. , (2009).
  9. Xu, B. WNK1, a novel mammalian serine/threonine protein kinase lacking the catalytic lysine in subdomain II. J Biol Chem. 275 (22), 16795-16801 (2000).
  10. McReynolds, A. C. Phosphorylation or Mutation of the ERK2 Activation Loop Alters Oligonucleotide Binding. Biochemistry. 55 (12), 1909-1917 (2016).
  11. Carlson, S. M. Large-scale discovery of ERK2 substrates identifies ERK-mediated transcriptional regulation by ETV3. Sci Signal. 4 (196), rs11 (2011).
  12. Courcelles, M. Phosphoproteome dynamics reveal novel ERK1/2 MAP kinase substrates with broad spectrum of functions. Mol Syst Biol. 9, 669 (2013).
  13. Myers, S. M. High-Throughput Screening and Hit Validation of Extracellular-Related Kinase 5 (ERK5) Inhibitors. ACS Comb Sci. 18 (8), 444-455 (2016).
check_url/55504?article_type=t

Play Video

Cite This Article
Karra, A. S., Stippec, S., Cobb, M. H. Assaying Protein Kinase Activity with Radiolabeled ATP. J. Vis. Exp. (123), e55504, doi:10.3791/55504 (2017).

View Video