Ensayo de la actividad de proteína quinasa con ATP radiomarcado
Summary
Las proteínas quinasas son enzimas de señalización altamente evolucionadas y andamios que son críticos para la transducción de señales inter e intracelulares. Se presenta un protocolo para medir la actividad quinasa mediante el uso de adenosina trifosfato radiomarcado ([γ- 32 P] ATP), un método fiable para ayudar a la elucidación de la regulación de señalización celular.
Abstract
Las proteínas quinasas son capaces de gobernar a gran escala los cambios celulares en respuesta a complejas matrices de estímulos, y mucho esfuerzo se ha dirigido a descubrir los detalles alostéricos de su regulación. Las quinasas comprenden redes de señalización cuyos defectos son a menudo características de múltiples formas de cáncer y enfermedades relacionadas, haciendo que una plataforma de ensayo sea susceptible de manipulación de factores reguladores aguas arriba y validación de requerimientos de reacción críticos en la búsqueda de terapias mejoradas. Aquí, describimos un ensayo de quinasa básico que se puede adaptar fácilmente para adaptarse a preguntas experimentales específicas incluyendo, pero sin limitarse a, ensayar los efectos de agentes bioquímicos y farmacológicos, manipulaciones genéticas tales como mutación y deleción, así como condiciones de cultivo celular y tratamientos para investigar Mecanismos de señalización celular. Este ensayo utiliza [γ-32P] ATP radiomarcado, que permite comparaciones cuantitativas y visualización clara de los resultados, y puede ser modPara uso con quinasa inmunoprecipitada o recombinante, sustratos específicos o tipificados, en una amplia gama de condiciones de reacción.
Introduction
Las proteínas quinasas son sofisticadas enzimas críticas para la transmisión de señales celulares en respuestas apropiadas 1 . Dado su papel en el mantenimiento de la homeostasis y la prevención o promoción de estados de enfermedad [ 2] , los métodos bioquímicos para evaluar la actividad quinasa siguen siendo herramientas poderosas para delinear los detalles de la señalización eucariótica [ 3] . Aunque las estrategias que utilizan anticuerpos fosfo-específicos han sido altamente informativas en términos de medir los efectos de diferentes condiciones de tratamiento en el estado de señalización celular 4 , un ensayo de quinasa permite medir los efectos de diferentes condiciones de tratamiento directamente en términos de la actividad enzimática de una quinasa de interesar. Si bien existen varias opciones para ensayos similares que no utilizan materiales radiactivos 5 , seguimos dependiendo de este método para una cuantificación robusta de los resultados. AhíSon dos aplicaciones típicas de este ensayo, ambas valiosas por diferentes razones: el ensayo de quinasa inmunoprecipitada (IP) ( Figura 1 ) y el ensayo de proteína quinasa recombinante ( Figura 2 ).
El ensayo de IP quinasa es tremendamente útil para identificar factores capaces de activar proteínas quinasas específicas así como para calibrar condiciones de tratamiento inhibidor. Brevemente, se transfecta una cinasa marcada con epítopo de interés en células eucariotas cultivadas, se somete a una variedad de tratamientos, se inmunoprecipita y se determina la capacidad para incorporar fosfato radiomarcado en un sustrato modelo ( por ejemplo, proteína básica de mielina (MBP)). IP kinasa también se puede realizar sin recurrir a la sobreexpresión, ya sea por inmunoprecipitación de proteínas endógenas o cualquier número de técnicas de edición del genoma. Debido a que los tratamientos se administran en cultivo, este método puede detectar estimulaciones transmitidas a través de múltiples factores ascendentesO vías paralelas por lectura in vitro . Una ventaja importante de este método es que no requiere conocimiento previo de factores directos de aguas arriba o aguas abajo o sitios de fosforilación en el mismo. Además, una vez que se han identificado sustratos específicos para una quinasa de interés, se puede usar el mismo protocolo de ensayo de quinasa con componentes recombinantes para medir actividad específica hacia sustratos naturales e identificar sitios específicos de fosforilación cuando se combinan con análisis de espectrometría de masas. Los sitios identificados de esta manera pueden validarse adicionalmente con ensayos de quinasa utilizando sustratos de sustrato. Por último, este método también puede usarse para detectar y medir la autofosforilación.
El protocolo proporcionado aquí asume un esquema de purificación de proteínas optimizado o un método de transfección para expresar una quinasa marcada por afinidad de interés en células cultivadas. Para exposiciones más detalladas de transfección, lisis, inmunoprecipitación y protOcols, sugerimos referirse a Cold Spring Harbor Protocolos 6 . Para obtener más información sobre el desarrollo del ensayo y la modificación, consulte la Fosforilación de Proteínas: Selected Methods in Enzymology 7 .
Protocol
Representative Results
Discussion
Las quinasas son una familia diversa de proteínas que han desarrollado una amplia funcionalidad en numerosos contextos, y los ensayos de quinasa han sido increíblemente útiles en el estudio de varias proteínas de señalización y han contribuido en gran medida a nuestra comprensión actual de la comunicación celular. En particular, se utilizó el mismo ensayo básico para caracterizar dos cinasas dispares a pesar de diferencias importantes en estructura y actividad. WNK1 contiene una bolsa catalítica atípica dond…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores agradecen a todos los miembros actuales y antiguos del laboratorio de Cobb por trabajos valiosos y discusiones, y Dionne Ware por asistencia administrativa. Estos estudios fueron apoyados por los Institutos Nacionales de Salud Grant R37 DK34128 y Welch Foundation Grant I1243 a MHC
Materials
| Protein A Sepharose CL-4B | GE Healthcare Life Sciences | 17-0963-03 |
| Radiolabeled [γ-32P] ATP | Perkin Elmer | NEG035C010MC |
| Laemmli Buffer | Bio-Rad | #1610737 |
| Radioactive shielding | Research Products International | BR-006 |
| R-250 dye (Coomassie) | Thermo Fisher | 20278 |
| Whatman Grade 3 qualitative filter paper | Whatman | 1003-917 |
| Slab gel vacuum dryer | Bio-Rad | Model 583 Gel Dryer #1651745 |
| Autorad marker | Agilent Technologies | 420201 |
| Phosphorescent ruler | Sigma Aldrich | R8133 |
| Phosphorescent dots | Sigma Aldrich | L5149 |
| Geiger counter | Ludlum | Model 3 with 44-9 detector |
| BioMax Cassette 8×10" | Carestream Health | 107 2263 |
| BioMax MS Film 8×10" | Carestream Health | 829 4985 |
| BioMax MS Intensifying Screen 8×10" | Carestream Health | 851 8706 |
| Medical/X-ray film processor | Konica Minolta | SRX-101A |
| Scintillation vials | Research Products International | 125500 |
| Scintillation fluid | MP Biomedicals | 188245305 |
| Beckman LS 6500 Scintillation counter | Beckman | LS 6500 |
References
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