Enkelt Molecule Analyse av Laser Lokalisert psoralen addukter

Summary

Lasere blir ofte brukt i studier av den cellulære respons på DNA-skade. Imidlertid genererer de lesjoner hvis avstand, frekvens og kollisjoner med replikasjonsgafler er sjelden karakterisert. Her beskriver vi en tilnærming som gjør det mulig å bestemme disse parametrene med laser lokalisert interkjedede kryssbindinger.

Abstract

DNA-skade Response (DDR) har blitt grundig karakterisert ved studier av dobbeltstrengbrudd (DSB) indusert ved laserbestråling mikro i levende celler. DDR til helix forvrengt kovalente DNA modifikasjoner, inkludert DNA interkjedede tverrbindinger (ICLs), ikke er så godt definert. Vi har studert DDR stimulert av ICLs, lokalisert ved laser fotoaktivering av immunotagged psoralens, i kjernen av levende celler. For å løse grunnleggende spørsmål om addukt distribusjon og replikasjonsgaffelen møter, kombinert vi laser lokalisering med to andre teknologier. DNA-fibre blir ofte brukt for å vise utviklingen av replikasjonsgafler ved immunofluorescens av nukleosidanaloger innarbeidet under korte pulser. Immunoquantum prikker har blitt mye brukt for enkelt molekyl bildebehandling. I den nye fremgangsmåten blir DNA-fibre fra celler som bærer laser lokalisert ICLs spredd ut på objektglass. De merkede ICLs vises med immunoquantum prikker og the inter-lesjon avstander bestemmes. Replication fork kollisjoner med ICLs kan visualiseres og ulike møter mønstre identifisert og kvantifisert.

Introduction

DNA er under konstant angrep fra eksogene midler slik som stråling, ultrafiolett lys, miljøgifter, forbrenningsprodukter, etc. I tillegg er det også angrepet av endogene radikal-forbindelser fremstilt ved oksidativ metabolisme. Alle disse har potensial til å kjemisk eller fysisk å bryte integriteten av ^DNA-1. Forstyrrelser i genomet kan aktivere DNA skade respons (DDR), en rekruttering og posttranslasjonell modifikasjon kaskade med hundrevis, om ikke tusenvis, av proteiner og microRNAs som er involvert i lesjonen reparasjon, regulering av cellesyklusen, apoptose, begynnende alderdom, og inflammatoriske trasé ^2.

De fleste av våre informasjon om DDR kommer fra studier med DSB sin. Dette er i stor grad på grunn av tilgjengeligheten av teknologier for innføring av pauser, inkludert sekvensspesifikke pauser, i genomisk DNA i levende celler ^3. I tillegg propensity av pauser for å indusere foci av DDR-proteiner, noe som kan vises ved immunfluorescens, har vært svært nyttig for å identifisere de kinetikk og kravene til responderende proteiner. En av de viktigste teknologiene for å studere DDR ble introdusert av Bonner og kolleger, som brukte en laserstråle til å lede en stripe av DSB sin i en "Region of Interest" (ROI) i kjernen av levende celler ^4. I praksis, skapte de en lang fokus hvori proteinene ifølge DDR kunne identifiseres ved immunfluorescens. Dette ble vist ved deres demonstrasjon av den sterke stripe av fosforylert histon H2AX (γ-H2AX) i laser eksponerte celler. Siden den gang har laseren fremgangsmåte blitt anvendt i mange studier av DDR-indusert av DSB. Selv kraftig og populært, og kilden til dramatiske immunfluorescens bilder, bør det bemerkes at i de fleste eksperimenter laser intensiteten justeres slik at det blir observer resultater, uten bekymring for lesjon identitet,tetthet eller avstand. Faktisk kan det være vanskelig å gjøre disse estimatene. Dermed er de i stor grad ignorert, til tross for mangfoldet av lesjoner innført i DNA av lasere ^5. Dette bidrar til de mange motsetninger i litteraturen ^6.

I motsetning til DSB, har de fleste kjemiske modifikasjoner av DNA som ikke stimulere dannelsen av diskrete områder med DDR proteiner. Dette er viktig i lys av vår nåværende forståelse av lesjon frekvenser. Det har blitt anslått at humane celler i kultur medføre så mange som 50 DSB per cellesyklus, dannet hovedsakelig under S-fase ^{7, 8, 9.} Færre er dannet i ikke-prolifererende celler. Dette står i kontrast med det antall nukleobasen tap eller endringshendelser, som er i titusener pr celle / dag ^{1, 10.} Dermed vet vi mest omDDR indusert av hendelser som er forholdsvis sjeldne, og mye mindre om de som fremkalles av heliksen forvrenge lesjoner, som til sammen er langt mer vanlig.

For å løse spørsmål om den cellulære responsen overfor kovalente modifikasjoner av genomisk DNA, ønsket vi å arbeide med en helix forvrengt DNA-addukt som hadde iboende DDR induksjonsaktivitet. Videre, for å lette eksperimentell design og tolkning vi var interessert i en struktur hvis innføring kunne kontrolleres med hensyn til tid og var mottagelig for visualisering. Følgelig har vi utviklet en strategi basert på psoralen. Psoralener er godt karakterisert fotoaktive DNA-interkalatorer som begunstiger 5' TA: AT områder. I motsetning til andre tverrbindingsmidler som for eksempel nitrogensenneper og mitomycin C (MMC) de er ikke DNA-reaktive med mindre utsatt for langbølget UV (UVA-lys). De innskutte molekylene reagerer med tymin baser på motsatte tråder for å fremstille spiral forvrengt interkjedede tverrbindinger (ICLs) ^11. Med trimetyl psoralen ble benyttet i forsøkene de fleste produkter er ICLs, relativt få monoadducts er generert (mindre enn 10%) ^12, og intrakjede tverrbindinger mellom nærliggende baser på den ene tråden blir ikke dannet. Fordi de er kraftige blokker til replikasjon og transkripsjon, psoralen og andre tverrbindingsmidler, slik som cis-platina og MMC, blir ofte brukt i kjemoterapi. Således psoralen aktivert studier som fulgte etter aktivering av DDR med en spiral forvrenge struktur, og også gitt innsikt i den cellulære responsen overfor en forbindelse med klinisk betydning.

Vi har syntetisert et reagens hvor trimetyl psoralen var knyttet til digoksigenin (Dig), en plantesterol ikke finnes i pattedyrceller og ofte brukt som en immunotag. Kravet for fotoaktivering tillater lokalisering av laserlys (365 nm) av psoralen ICLs i ROI definert i kjerner i levende celler. Disse kan vises ved immunofluorescence mot Dig tag. DNA-reparasjon og DDR proteinene synes i striper av laser lokaliserte ICLs ^{13, 14.}

DDR aktiveres av de høye laserintensitet som anvendes for å fremstille DSB kan skyldes isolert eller gruppert skade ^{15, 16.} Følgelig relevansen av resultatene fra disse forsøkene til naturlig forekommende lesjoner til stede med mye lavere konsentrasjon, er usikkert. For å møte lignende spørsmål om psoralen addukt frekvens og avstand i DNA, vi tok fordel av DNA fiberteknologi ¹⁷ og immunoquantum prikker. Kvanteprikker er mye lysere enn fluorescerende fargestoffer og er ikke bleket ved eksponering for lys. Dermed er de ofte brukt for enkelt molekyl avbildning ^18, en søknad som fluorescerende fargestoffer er utilstrekkelig lys. Individuelle DNA-fibre kan strekkes på glass lysbilder og kan vises ved immunfluorescens mot nukleosidanaloger innarbeidet under inkubering før celle innhøsting. Vi behandlede celler med Dig-psoralen og eksponert ROI til laseren mikro bestråling. Fibre ble fremstilt fra cellene og enkelte Dig-psoralen-addukter kan bli visualisert med de immunoquantum prikker. Å utsette cellene for nukleosidanaloger for forholdsvis kort tid (20-60 min) tillater visning av replikasjonskanalen i nærheten av laser lokalisert ICLs.

Protocol

1. Fremstilling av Dig-TMP Bland 50 mg (0,18 mmol) 4'-klormetyl-4,5' , 8-trimethylpsoralen og 590 mg (2,7 mmol) av 4,7,10-trioksa-1,13-tridecanedi-amin i en tørr 25 ml rund -bottom kolbe under nitrogen. Tilsett 10 ml toluen og tilbakeløpskjøling i 12 timer. Fjern løsningsmidlet i en rotasjonsfordamper under redusert trykk. Rens residuet ved flash-kolonnekromatografi over silicagel. Kolonnen ble eluert med kloroform, metanol og 28% ammoniakkløsning (9: 1: 0,5). Fordamp l?…

Representative Results

Laser lokaliserte Dig-TMP (figur 1A) ICLs kan vises ved immunfluorescens mot Dig-tag koblet til psoralen. Selv om laseren kan rettes for å slå på et område av en hvilken som helst kontur, striper er ikke "naturlige" form i celler, og legitime signaler som lett kan skilles fra artifakter på grunn av ikke-spesifikk binding av primære eller sekundære antistoffer. Denne funksjonen er nyttig når du bruker antistoffer på mindre enn perfekt spesifisitet. Et e…

Discussion

Laseren lokaliseringsteknologi krever bruk av adherente celler med kjerner som er synlige i lysfelt-mikroskopi. Vi har forsøkt å feste ikke-adherente celler, så som primære lymfocytter, eller løs klebrig dyrkede celler slik som AD293, med glassoverflaten med celle adhesive preparater, så som polylysin eller kollagen, eller mer komplekse blandinger. Selv om disse behandlingene kan binde cellene til overflaten, finner vi at de som regel bli avrundet noe som gjør det svært vanskelig å fokusere på kjernen. Videre …

Materials

Digoxigenin NHS ester	Sigma-Aldrich	11333054001
Chloro-psoralen	Berry and Associates	PS 5000
diaminoglycol	Sigma-Aldrich	369519	4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine
Chloroform	Acros Organics	423550040
Methanol	Fisher Scientific	A4524
Ammonium solution	Sigma-Aldrich	5002
TLC plates	Analtech, Inc.	P02511
Flass glass column 24/40, 100ml	Chemglass Life Sciences	CG-1196-02
Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder	Perkin Elmer		With Volocity Software
Micropoint Galvo	Andor Technologies		with a Nitrogen pulsed laser
dye cell	Andor Technologies	MP-2250-2-365
365 dye	Andor Technologies	MP-27-365-DYE
IdU	Sigma-Aldrich	17125
35mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10mm glass diameter, uncoated	Matek	P35G-1.5-10-C
microscope slides	New Comer Supply	Part # 5070	New Silane Slides
Mouse anti BrdU antibody (IdU)	BD Biosciences	347580	1 in 40
Rat anti BrdU Antibody (CldU)	Abcam	ab6326	1 in 200
Rabbit anti Dig antibody	ThermoFisher Scientific	710019	1 in 200
Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG	ThermoFisher Scientific	Q-11421MP	1 in 5000
AF647- goat anti Rat IgG	Jackson Immunoresearch	112-605-167	1 in 100
AF488-goat anti mouse IgG	Jackson Immunoresearch	115-545-166	1 in 100
Zeiss epifluorescent microscope A200	Zeiss		with Axiovision software
Q-dot 655 filter	Chroma	39107