Enda molekyl Analys av Laser Lokaliserade psoralen Addukter

Summary

Lasrar används ofta i studier av cellulärt svar på DNA-skada. Emellertid, de genererar lesioner vars avstånd, frekvens, och kollisioner med replikationsgafflar sällan känne. Här beskriver vi en metod som gör det möjligt att bestämma dessa parametrar med laser lokaliserad interstrand tvärbindningar.

Abstract

DNA Damage Response (DDR) har i stor utsträckning kännetecknad av studier av dubbelsträngsbrott (DSB) inducerade av lasermikrostråle bestrålning i levande celler. DDR att helix snedvrida kovalenta DNA-modifieringar, inklusive interstrand DNA tvärbindningar (ICLs), inte är lika väl definierade. Vi har studerat DDR stimuleras av ICLs, lokaliseras genom laserfotoaktivering av immunotagged psoralener, i kärnan av levande celler. För att ta itu med grundläggande frågor om distributions addukt och replikationen möten, vi kombinerat laser lokalisering med två andra tekniker. DNA-fibrer används ofta för att visa förloppet för replikationsgafflar genom immunofluorescens av nukleosidanaloger inkorporerade under korta pulser. Immunoquantum punkter har i stor utsträckning använts för enda molekyl avbildning. I den nya metoden, är DNA-fibrer från celler som bär laser lokaliserade ICLs spreds ut på objektglas. De märkta ICLs visas med immunoquantum prickar och the inter lesion avstånd bestäms. Replikationsgaffeln kollisioner med ICLs kan visualiseras och olika möter mönster identifieras och kvantifieras.

Introduction

DNA är under konstant angrepp från exogena medel, såsom strålning, ultraviolett ljus, miljögifter, förbränningsprodukter, etc. Dessutom är det också attackeras av endogena radikaler producerade av oxidativ metabolism. Alla dessa har potential att kemiskt eller fysikaliskt störa integriteten av DNA ^1. Störningar i genomet kan aktivera DNA-skador Response (DDR), en rekrytering och posttranslationell modifiering kaskad med hundratals, om inte tusentals, proteiner och mikroRNA involverade i lesion reparation, reglering av cellcykeln, apoptos, senescens, och inflammatoriska reaktionsvägar ^2.

De flesta av våra uppgifter om DDR kommer från studier med DSB. Detta är till stor del på grund av tillgängligheten av teknik för att införa pauser, inklusive sekvensspecifika raster, i genomiskt DNA i levande celler ^3. Dessutom, propensity pauser för att framkalla härdar av DDR proteiner, som kan visas genom immunofluorescens, har varit till stor hjälp för att identifiera kinetiken och krav svara proteiner. En av de viktigaste teknikerna för att studera DDR infördes av Bonner och kollegor, som använde en laserstråle för att rikta en rand av DSB i en "Region of Interest" (ROI) i kärnan av levande celler ^4. I själva verket skapade de en lång fokus vilka proteiner i DDR kunde identifieras genom immunofluorescens. Detta illustrerades av sin demonstration av den starka rand av fosforylerad histon H2AX (γ-H2AX) i laser exponerade celler. Sedan dess har laser tillvägagångssätt använts i ett flertal studier av DDR inducerade av DSB. Även kraftfulla och populära, och källan till dramatiska immunofluorescens bilder, bör det noteras att laserintensiteten i de flesta experiment justeras för att åstadkomma observer resultat, utan oro för skada identitet,densitet, eller avståndet. I själva verket kan det vara svårt att göra dessa beräkningar. De är således till stor del ignoreras, trots mångfalden av lesioner som införs i DNA genom lasrar ^5. Detta bidrar till de många motsägelser i litteraturen ^6.

I motsats till DSBs, de flesta kemiska modifikationer av DNA som inte stimulera bildandet av diskreta foci av DDR-proteiner. Detta är viktigt med tanke på vår nuvarande förståelse av skada frekvenser. Det har uppskattats att humana celler i odling ådra så många som 50 DSB per cellcykeln, bildade i stort sett under S-fas ^{7, 8, 9.} Färre är formade i icke-prolifererande celler. Detta står i kontrast med antalet nukleobas förluster eller modifierings händelser, som i de tiotusentals per cell / dag ^{1, 10.} Således vet vi mest omDDR induceras av händelser som är relativt sällsynta, och mycket mindre om de som induceras av spiral snedvrida skador som sammanlagt är betydligt vanligare.

För att ta itu med frågor om det cellulära svaret på Kovalenta modifieringar av genomiskt DNA, ville vi arbeta med en helix förvränga DNA-addukt som hade inneboende DDR induktionsaktivitet. Dessutom för att underlätta experimentell design och tolkning vi var intresserade av en struktur vars inledning kunde kontrolleras med avseende på tid och var mottagliga för visualisering. Således har vi utvecklat en strategi baserad på psoralen. Psoralener är väl karakteriserade fotoaktiva DNA-interkalatorer som gynnar 5' TA: AT webbplatser. Till skillnad från andra tvärbindningsmedel, såsom kvävesenaper och mitomycin C (MMC) de är inte DNA reaktiva såvida exponeras för långvågig UV (UVA) ljus. De inskjutna molekyler reagerar med tymin baser på motsatta strängar för att producera spiral snedvrida interstrand tvärbindningar (ICLs) ^11. Med trimetyl psoralen som används i våra experiment de flesta produkterna är ICLs, relativt få monoaddukter genereras (mindre än 10%) ¹² och intrastrand tvärbindningar mellan intilliggande baser på en sträng inte är bildade. Eftersom de är kraftfulla block till replikation och transkription, psoralen och andra tvärbindningsmedel, såsom cis-platina och MMC, används ofta i kemoterapi. Sålunda psoralen aktiverade studier som följde aktiveringen av DDR genom en spiral förvränga struktur, och även anordnade insikt i den cellulära responsen till en förening med klinisk betydelse.

Vi syntetiserade ett reagens i vilket trimetyl psoralen var kopplat till digoxigenin (DIG), en växtsterol som inte finns i däggdjursceller och används ofta som en immunotag. Kravet på fotoaktivering medger lokalisering av laserljus (365 nm) av psoralen ICLs i definierade ROI i kärnor i levande celler. Dessa kan visas genom IMMunofluorescence mot Dig taggen. DNA-reparation och DDR-proteiner dök upp i ränder av laser lokaliserade ICLs ^{13, 14.}

DDR aktiveras av de höga laserintensiteter används för att producera DSB skulle kunna bero på isolerad eller klustrade skada ^{15, 16.} Följaktligen relevansen av resultaten från dessa experiment för att naturligt förekommande lesioner, närvarande vid mycket lägre koncentration, är osäkert. Att ta itu med liknande frågor om psoralen addukt frekvens och avstånd i DNA, tog vi fördel av DNA-fiberteknologi ¹⁷ och immunoquantum prickar. Kvantprickar är mycket ljusare än fluorescerande färger och inte bleks av exponering för ljus. De är således ofta för enda molekyl avbildning ^18, en tillämpning för vilken fluorescerande färgämnen är otillräckligt ljus. Individuella DNA fibrer kan sträckas på glass diabilder och kan visas genom immunofluorescens mot nukleosidanaloger inkorporerade under inkubationer före cellskörd. Vi behandlade celler med Dig-psoralen och exponeras ROI till lasermikro bestrålning. Fibrer framställdes från cellerna och enskilda gräver-psoralen addukter kunde visualiseras med immunoquantum prickar. Exponering av cellerna för nukleosidanaloger under relativt korta tider (20-60 min) möjliggör visning av replikerings skrifter i närheten av laser lokaliserad ICLs.

Protocol

1. Framställning av Dig-TMP Blanda 50 mg (0,18 mmol) 4'-klormetyl-4,5' , 8-trimetylpsoralen och 590 mg (2,7 mmol) av 4,7,10-trioxa-1,13-tridecanedi-amin i en torr 25 ml rund -bottom kolv under kväve. Lägga 10 ml toluen och återflöde i 12 h. Avlägsna lösningsmedlet i en rotationsindunstare under reducerat tryck. Rena återstoden med flash-kolonnkromatografi över silikagel. Eluera kolonnen med kloroform, metanol och 28% ammoniaklösning (9: 1: 0,5). Indunsta lösningsme…

Representative Results

Laser lokaliserade Dig-TMP (Figur 1A) ICLs kan visas genom immunofluorescens mot Dig-tagg kopplad till psoralen. Även om lasern kan riktas att slå i ett område i varje kontur, band inte är "naturliga" former i celler, och legitima signaler kan lätt särskiljas från artefakter på grund av icke-specifik bindning av primära eller sekundära antikroppar. Den här funktionen är användbar när man använder antikroppar som är mindre än perfekt specificite…

Discussion

Laserlokaliseringsteknik kräver användning av fastsittande celler med kärnor som är synliga i starkt fält mikroskopi. Vi har försökt att fästa icke-adherenta celler, såsom primära lymfocyter, eller löst vidhäftande odlade celler, såsom AD293, vid glasytan med cellklisterberedningar såsom polylysin eller kollagen, eller mer komplexa blandningar. Även om dessa behandlingar kan binda cellerna till ytan, finner vi att de i allmänhet hålla rundade vilket gör det mycket svårt att fokusera i kärnorna. Dessu…

Materials

Digoxigenin NHS ester	Sigma-Aldrich	11333054001
Chloro-psoralen	Berry and Associates	PS 5000
diaminoglycol	Sigma-Aldrich	369519	4,7,10-Trioxa-1,13-tridecanediamine
Chloroform	Acros Organics	423550040
Methanol	Fisher Scientific	A4524
Ammonium solution	Sigma-Aldrich	5002
TLC plates	Analtech, Inc.	P02511
Flass glass column 24/40, 100ml	Chemglass Life Sciences	CG-1196-02
Nikon T2000_E2 spinning disk confocal microscope, equipped with automated stage and environmental control chamber and plate holder	Perkin Elmer		With Volocity Software
Micropoint Galvo	Andor Technologies		with a Nitrogen pulsed laser
dye cell	Andor Technologies	MP-2250-2-365
365 dye	Andor Technologies	MP-27-365-DYE
IdU	Sigma-Aldrich	17125
35mm glass botomm plates 1.5 coverslip, 10mm glass diameter, uncoated	Matek	P35G-1.5-10-C
microscope slides	New Comer Supply	Part # 5070	New Silane Slides
Mouse anti BrdU antibody (IdU)	BD Biosciences	347580	1 in 40
Rat anti BrdU Antibody (CldU)	Abcam	ab6326	1 in 200
Rabbit anti Dig antibody	ThermoFisher Scientific	710019	1 in 200
Q-dot 655 goat anti Rabbit IgG	ThermoFisher Scientific	Q-11421MP	1 in 5000
AF647- goat anti Rat IgG	Jackson Immunoresearch	112-605-167	1 in 100
AF488-goat anti mouse IgG	Jackson Immunoresearch	115-545-166	1 in 100
Zeiss epifluorescent microscope A200	Zeiss		with Axiovision software
Q-dot 655 filter	Chroma	39107