3D 회전 타원체 생산을위한 효율적이고 유연한 셀 집계 방법
Summary
Here, we describe a rapid and flexible protocol for the formation of 3D cell spheroids through cell aggregation. This is easily adapted to multiple cell types and is suitable for use in a variety of applications including cell migration, invasion, or anoikis assays, and for imaging and quantifying cell-matrix interactions.
Abstract
단층 세포 배양 충분히 복잡한 세포 – 세포 및 세포 – 기질 상호 작용을 포함한다 조직의 생체 내 행동을 모델링하지 않습니다. 3 차원 (3D) 세포 배양 기술을 접착 세포 배양의 단점을 해결하기 위해 개발 된 최근의 기술 혁신이다. 시험관 내에서 조직 유사체를 생성하기위한 몇 가지 기술이 개발되었지만,이 방법은 비용이 확립 자주 복잡 특수 장비를 필요로하고, 일반적으로 특정 유형의 세포와의 호환성에 의해 제한된다. 여기서는 종양 정상적인 다양한 세포주의 성장과 호환 일관된 크기 다세포 차원 타원체로 세포 응집을위한 신속하고 유연한 프로토콜을 설명한다. 우리 앵커리지 독립적 타원체 생성을 촉진하고, 높은 재현성으로 세포 단층의 형성을 방지하기 위해 혈청 및 메틸 셀룰로오스 (MC)의 다양한 농도를 사용한다. 개인 라지을위한 최적의 조건idual 세포주 회전 타원체 형성 매체 MC 또는 혈청 농도를 조정함으로써 달성 될 수있다. 생성 된 3D 타원체 셀 시그널링 또는 유전자 발현 연구 후보 약물 스크리닝, 또는 종양 세포의 침윤 및 이동과 같은 세포 과정의 연구 등의 다양한 애플리케이션에 사용하기 위해 수집 될 수있다. 프로토콜은 또한 용이하게 단일 세포 클론 타원체를 생성하도록 구성되고, 앵커리지 – 독립된 성장 anoikis 저항을 평가하도록 구성 될 수있다. 전체적으로, 우리는 프로토콜을 생성하고, 정상 및 종양 세포의 생체 내 성장을 조직의 3 차원 미세 요점을 되풀이하고 모델링하기 위해 3 차원 셀 타원체를 이용하는 쉽게 수정 방법을 제공한다.
Introduction
종양 세포의 생물학적 행위 관련 사정이 적절히 생체 내에서 발견되는 세포 미세 환경을 반영하지 않기 때문에, 부분적으로는 기존의 2 차원 세포 배양 방법을 사용하여 도전하고있다. 배양 (예, 보이든 챔버 분석법)에 세포 외 기질 성분을 통합하는 대안 적 방법은 생체 조직 환경 이상의 생리 대표. 그러나, 개별 셀 동작의 평가에 한정 될 수 있으며, 조직 또는 종양 성장을 1, 2, 3에 기여하는 세포 기질 및 세포 – 세포 상호 작용의 생체 조합 복소 요점을 되풀이하지 않는다.
다세포 타원체의 사용은,보다 정확하게 생체 내 세포 성장 (1)의 콤팩트 한 구조를 재생하는 방법이다 최근4. 구 상체는 정상 세포의 세포 – 기질 상호 작용을 조사하기 위하여 사용될 수 있으며,뿐만 아니라, 전이성 성장 또는 약물 내성 4와 같은 종양 진행의 특성을 모델링하기 위해, 종양 유사체로서 작용할 수있다.
타원체가 매트릭스 5 또는 더 빠르게 내장 단일 세포의 증식에 의해 형성 될 수 있고, 다수의 세포의 응집을 촉진함으로써 단일 셀 클러스터 (예를 들어, 걸려 강하를 원심 분리 방법) (6, 7)을 형성한다. 기존의 세포 응집 기술은 비용이 많이 드는 재료 또는 특수 장비가 필요할 수 있습니다. 또한, 이러한 회전 타원체는 크기 및 모폴로지의 넓은 범위가 성장 조건이나 곤란 치료 간의 비교를, 대량 생산하기가 어려울 수있다. 마지막으로, 이러한 방법에 의해 생성 된 타원체는 단백질 extracel에서 분리하기가 어려울 수 있습니다적인 다공질 행렬을하는 그들은 다른 응용 프로그램에서 사용하기 위해 포함됩니다.
여기에서는 시판 U 바닥 셀 반발 판 불활성 접착 촉진 행렬 메틸 셀룰로오스를 이용하여 지속적으로 크기가 셀 타원체의 신속한 형성을위한 견고하고 용이하게 수정 세포 응집 방법을 설명한다. 형성 후에,이 다세포 타원체 용이하게 다양한 애플리케이션에서 사용하기 위해 분리된다. 프로토콜은 쉽게 다른 세포 프로세스를 평가하기 위해 사용될 수있다 세포 증식을 통해 구 상체를 생성하도록 구성된다. 여기, 우리는이 두 개의 서로 다른 회전 타원체 형성 프로토콜의 예 응용 프로그램과 같은 면역 형광 염색법에 의해 정량화 셀 침공 분석, 및 anoikis 분석은 보여줍니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
우리는 저렴하고 광범위하게 이용할 시약을 이용하여 생체 조직의 구조를 모델링하는 3 차원 셀 구 상체를 제조하기위한 신속하고 융통성있는 방법을 제시한다. 우리 프로토콜 MC (8, 9)의 비 독성 및 접착 촉진 성질 세포 응집을 매개 세포 단층의 형성을 최소화하기를 이용한다. 동물 소스로부터 단리 된 단백질 – 기초 매트릭스는 달리, MC는 불활?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors thank M. Gordon of the Queen’s University Biomedical Imaging Centre for assistance. This work was supported by operating grants from the Cancer Research Society of Canada (19439) and the Canadian Institutes for Health Research (MOP-142303) (LMM), and by Ontario Graduate Scholarships and studentships from the Terry Fox Research Institute Training Program in Transdisciplinary Cancer Research (SMM, EYL), and by a Craig Jury Summer Studentship (SMM).
Materials
| Buffers | |||
| 10x Phosphate buffered saline | Thermo Fisher Scientific | AM9625 | |
| Calcium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | 21114 | Used for PBS* wash buffer; Do not autoclave PBS* wash buffer upon addition of calcium chloride |
| Magnesium Chloride Solution | Sigma-Aldrich | M1028 | Used for PBS* wash buffer; Do not autoclave PBS* wash buffer upon addition of magnesium chloride |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Spheroid Formation | |||
| 96-well U-bottom Cell-Repellent Plate | Greiner Bio-One | 650970 | |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium | Sigma-Aldrich | D5546 | For culturing SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 cell lines |
| F12K Medium | Thermo Fisher Scientific | 2112722 | For culturing TT cell line |
| Fetal Bovine Serum | Sigma-Aldrich | F1051 | Filter prior to use to remove particulate contaminants |
| Methyl cellulose | Sigma-Aldrich | M7027 | Prepare in water to 100 mg/mL |
| Roswell Park Memorial Institute Medium | Sigma-Aldrich | R8758 | For culturing HCT-116, BxPC-3 cell lines |
| TrypLE Express | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | Dissociation buffer |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Invasion Assay | |||
| Bovine Type I Collagen | Corning Incorporated | 354231 | Stock 3.1mg/ml; Maintain on ice when in use |
| DMEM Phenol Red Free Low Glucose | Thermo Fisher Scientific | 11054-20 | Less background fluorescence compared to Phenol Red supplemented medium |
| Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor | Peprotech | 450-10 | Chemoattractant |
| Name | Company | Catalog number | Comments |
| For Immunofluorescence Microscopy | |||
| #1.5 Coverglass | Electron Microscopy Sciences | 72225-01 | For mounting excised spheroids |
| Alexa-Fluor 488 Phalloidin | Thermo Fisher Scientific | A12379 | Used to stain actin at 1:200 |
| Bovine Serum Albumin | Bioshop Canada Incorporated | ALB001 | Used in BSA blocking buffer |
| Dabco 33-LV | Sigma-Aldrich | 290734 | Antifade |
| Glycerol | Bioshop Canada Incorporated | GLY001 | Used in MOWIOL mounting medium |
| ImageJ Software | Freeware, NIH | – | Used for image analysis |
| Microslides | VWR International | 48312-024 | For mounting excised spheroids |
| MOWIOL 4-88 | EMD-Millipore | 475904 | Used in MOWIOL mounting medium |
| Paraformaldehyde | EMD-Millipore | PX0055-3 | Used in fixation buffer |
| Triton X-100 | Bioshop Canada Incorporated | TRX777 | Used in permeabilization buffer |
References
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