En effektiv och flexibel cell Aggregation Metod för 3D Spheroid Production

Summary

Here, we describe a rapid and flexible protocol for the formation of 3D cell spheroids through cell aggregation. This is easily adapted to multiple cell types and is suitable for use in a variety of applications including cell migration, invasion, or anoikis assays, and for imaging and quantifying cell-matrix interactions.

Abstract

Monolager cellodling inte tillräckligt modellera beteendet in vivo av vävnader, vilket inbegriper komplicerade cell-cell och cell-matrix-interaktioner. Tredimensionella (3D) cellodlingstekniker är en ny innovation utvecklats för att åtgärda bristerna i vidhäftande cellkultur. Medan flera tekniker för att generera vävnads analoger in vitro har utvecklats, dessa metoder är ofta komplexa, dyra att upprätta, kräver specialiserad utrustning och är i allmänhet begränsade av kompatibilitet med endast vissa celltyper. Här beskriver vi en snabb och flexibel protokoll för aggregering celler i flercelliga 3D sfäroider konsekvent storlek som är kompatibel med en tillväxt på en mängd olika tumör och normala cellinjer. Vi utnyttjar varierande koncentrationer av serum och metylcellulosa (MC) för att främja förankringsoberoende sfäroid generering och förhindra bildandet av cellmonoskikt på ett mycket reproducerbart sätt. Optimala förhållanden för individual cellinjer kan åstadkommas genom att justera MC eller serumkoncentrationerna i sfäroid formation mediet. 3D sfäroider som genereras kan samlas upp för användning i ett brett spektrum av tillämpningar, inklusive cellsignalering eller genuttryck studier, läkemedelskandidaten screening, eller i studier av cellulära processer såsom tumörcellinvasion och migration. Protokollet är också lätt anpassas för att generera klonala sfäroider från enstaka celler, och kan anpassas för att bedöma förankringsoberoende tillväxt och anoikis resistens. Sammantaget ger våra protokoll en lätt modifierbar metod för generering och användning av 3D-cell sfäroider för att rekapitulera 3D mikromiljö av vävnader och modellera tillväxten av normala celler och tumörceller in vivo.

Introduction

Biologiskt relevant bedömning av tumörcellbeteende utmanar med traditionella tvådimensionella (2D) cellodlingsmetoder, delvis på grund av dessa inte korrekt speglar cellmikro påträffats in vivo. Alternativa metoder som innehåller extracellulära matrixkomponenter i kulturen (t.ex. Boyden kammaranalyser) är mer fysiologiskt representativ för in vivo vävnadsmiljö. Däremot kan de begränsas till bedömning av enskilda cellbeteende, och inte rekapitulera komplexet in vivo kombinationer av cell-matrix och cell-cell-interaktioner som bidrar till vävnad eller tumörtillväxt ^{1, 2, 3.}

Användningen av flercelliga sfäroider är en ny metod som mer exakt återger den kompakta arkitektur in vivo celltillväxt ^14. Sfäroider kan användas för att undersöka cell-matris interaktioner av normala celler, men kan också fungera som tumör analoger för att modellera egenskaper hos tumörprogression, såsom metastatisk tillväxt eller läkemedelsresistens ^4.

Sfäroider kan bildas genom proliferationen av enskilda celler inbäddade i en matris ^5, eller snabbare, för att genom att främja aggregering av flera celler bildar en enda cellkluster (t.ex., hängande droppe, centrifugeringsmetoder) ^{6, 7.} Befintliga cell aggregering tekniker kan kräva kostsamma material eller specialutrustning. Dessutom är dessa sfäroider har ett brett utbud av storlekar och morfologier och kan vara svåra att producera i stora mängder, vilket gör jämförelser mellan tillväxtbetingelser eller behandlingar svåra. Slutligen kan sfäroider som genereras av dessa metoder vara svåra att isolera från det proteinhaltiga extracellular matris i vilken de är inbäddade för användning i andra tillämpningar.

Här beskriver vi en robust och lätt modifierbar cellaggregation metodik för snabb bildning av genomgående dimensionerade cell sfäroider användning av kommersiellt tillgängliga U-bottnade cellavvisande plattor och ett inert vidhäftningsbefrämjande matris, metylcellulosa. När den väl bildats, är dessa flercelliga sfäroider lätt isoleras för användning i ett brett spektrum av tillämpningar. Protokollet är också enkelt anpassas för att generera sfäroider genom cellproliferation, vilket kan användas för att utvärdera andra cellprocesser. Här visar vi cellinvasionsanalyser, kvantifierade genom immunofluorescens färgning, och en anoikis analys, som exempelvis tillämpningar av dessa två olika sfäroid formation protokoll.

Protocol

OBS: Alla reagens och förbrukningsartiklar listas i materiallistan. 1. Sfäroid Produktionen av Cell Aggregation Metylcellulosalösning: Bered 100 ml av 100 mg / ml metylcellulosa. Värme 50 ml ultrarent H2O till 80 ° C. Tillsätt 10 g metylcellulosa pulver och skaka tills partiklarna är jämnt dispergerad. Föra till slutlig volym med kall ultrarent H2O och rör om vid 4 ° C tills lösningen blir klar,…

Representative Results

Vi beskriver en flexibel och effektiv metod för att generera diskreta sfäroider med användning av cellavvisande plattor och sfäroida formations media kompletterade med MC. Under lämpliga betingelser av MC och serum, individuella celler sedimentera och vidhäftning i centrum av brunnen för att bilda sfäroider med minimal vidhäftning till brunnens botten. Användning av detta protokoll, var sfäroider genereras från en mängd olika cellinjer (Figur 2B). Titrering …

Discussion

Vi presenterar en snabb och flexibel metod för att producera 3D-cell sfäroiderna att modellera arkitektur in vivo vävnader med hjälp av billiga och lättillgängliga reagens. Vår protokoll utnyttjar icke-cytotoxiska och vidhäftningsbefrämjande egenskaperna hos MC ^{8, 9} att medla cell aggregering och minimera cellmonolager bildas. Till skillnad från proteinbaserade matriser som isolerats från djurkällor, är MC inert, innehåller inga tillväxtf…

Materials

Buffers
10x Phosphate buffered saline	Thermo Fisher Scientific	AM9625
Calcium Chloride Solution	Sigma-Aldrich	21114	Used for PBS* wash buffer; Do not autoclave PBS* wash buffer upon addition of calcium chloride
Magnesium Chloride Solution	Sigma-Aldrich	M1028	Used for PBS* wash buffer; Do not autoclave PBS* wash buffer upon addition of magnesium chloride
Name	Company	Catalog number	Comments
For Spheroid Formation
96-well U-bottom Cell-Repellent Plate	Greiner Bio-One	650970
Dulbecco's Modified Eagle's Medium	Sigma-Aldrich	D5546	For culturing SH-SY5Y, PANC-1, TPC-1 cell lines
F12K Medium	Thermo Fisher Scientific	2112722	For culturing TT cell line
Fetal Bovine Serum	Sigma-Aldrich	F1051	Filter prior to use to remove particulate contaminants
Methyl cellulose	Sigma-Aldrich	M7027	Prepare in water to 100 mg/mL
Roswell Park Memorial Institute Medium	Sigma-Aldrich	R8758	For culturing HCT-116, BxPC-3 cell lines
TrypLE Express	Thermo Fisher Scientific	12605028	Dissociation buffer
Name	Company	Catalog number	Comments
For Invasion Assay
Bovine Type I Collagen	Corning Incorporated	354231	Stock 3.1mg/ml; Maintain on ice when in use
DMEM Phenol Red Free Low Glucose	Thermo Fisher Scientific	11054-20	Less background fluorescence compared to Phenol Red supplemented medium
Glial Cell Line Derived Neurotrophic Factor	Peprotech	450-10	Chemoattractant
Name	Company	Catalog number	Comments
For Immunofluorescence Microscopy
#1.5 Coverglass	Electron Microscopy Sciences	72225-01	For mounting excised spheroids
Alexa-Fluor 488 Phalloidin	Thermo Fisher Scientific	A12379	Used to stain actin at 1:200
Bovine Serum Albumin	Bioshop Canada Incorporated	ALB001	Used in BSA blocking buffer
Dabco 33-LV	Sigma-Aldrich	290734	Antifade
Glycerol	Bioshop Canada Incorporated	GLY001	Used in MOWIOL mounting medium
ImageJ Software	Freeware, NIH	–	Used for image analysis
Microslides	VWR International	48312-024	For mounting excised spheroids
MOWIOL 4-88	EMD-Millipore	475904	Used in MOWIOL mounting medium
Paraformaldehyde	EMD-Millipore	PX0055-3	Used in fixation buffer
Triton X-100	Bioshop Canada Incorporated	TRX777	Used in permeabilization buffer