El shock hemorrágico no controlado se modela a través de la laceración hepática en ratones con monitorización hemodinámica en tiempo real

Summary

La hemorragia incontrolada, una importante causa de mortalidad entre los pacientes con traumatismo, puede ser modelada usando una laceración hepática estándar en un modelo murino. Este modelo resulta en pérdida de sangre consistente, supervivencia, y permite la prueba de agentes hemostáticos. Este artículo proporciona el proceso paso a paso para realizar este valioso modelo.

Abstract

La hemorragia no controlada es una causa importante de muertes evitables entre los pacientes traumatizados. Hemos desarrollado un modelo murino de hemorragia no controlada a través de una laceración hepática que da como resultado pérdida de sangre consistente, alteraciones hemodinámicas y supervivencia.

Los ratones se someten a una resección normalizada del lóbulo medio izquierdo del hígado. Se les permite sangrar sin intervención mecánica. Los agentes hemostáticos se pueden administrar como terapia de pretratamiento o de rescate dependiendo del interés del investigador. Durante el tiempo de la hemorragia, se realiza monitorización hemodinámica en tiempo real a través de una línea arterial femoral izquierda. Luego se sacrifican los ratones, se cuantifica la pérdida de sangre, se recoge sangre para un análisis posterior y se recogen los órganos para el análisis de la lesión. El diseño experimental se describe para permitir la prueba simultánea de múltiples animales.

Existe hemorragia hepática como modelo de hemorragia incontroladaN en la literatura, principalmente en modelos de ratas y porcinos. Algunos de estos modelos utilizan la monitorización hemodinámica o cuantifican la pérdida de sangre pero carecen de consistencia. El presente modelo incorpora la cuantificación de la pérdida de sangre, monitoreo hemodinámico en tiempo real en un modelo murino que ofrece la ventaja de usar líneas transgénicas y un mecanismo de alto rendimiento para investigar más a fondo los mecanismos fisiopatológicos en la hemorragia no controlada.

Introduction

El trauma es la principal causa de muerte y discapacidad entre los jóvenes de todo el mundo. ^{1 La} hemorragia incontrolada sigue siendo una de las principales causas de mortalidad entre los pacientes traumatizados gravemente heridos. ^{2 El} tratamiento del paciente con trauma hemorrágico es doble: control de la hemorragia quirúrgica y reanimación y reemplazo de sangre perdida.

Los modelos animales de choque hemorrágico han sido la piedra angular en la investigación de trauma y pueden ser utilizados en la evaluación de la fisiopatología y el tratamiento del shock traumático / hemorrágico. ^{3 , 4 El} shock en los modelos animales puede lograrse ampliamente por dos métodos: hemorragia controlada y hemorragia incontrolada. ^{5 , 6 La} hemorragia controlada se realiza mediante la extirpación de un volumen fijo de sangre o por extracción de sangre para lograr una determinada presión sanguínea (presión fija). Mientras que laAlgunos modelos son útiles en la evaluación de los mecanismos y alteraciones inmunitarias en el choque hemorrágico, no son aplicables a la prueba de agentes hemostáticos y no imitan el escenario clínico de hemorragia tras un traumatismo. En este sentido, se buscó desarrollar un modelo de hemorragia incontrolada que nos permitiera probar los cambios hemostáticos y los agentes procoagulantes en un modelo murino. El hígado es una opción atractiva para la hemorragia incontrolada en parte debido a la doble fuente de sangre al hígado y es uno de los órganos intrabdominal más comúnmente lesionados en el trauma romo y penetrante. Dada la alta relevancia clínica, el hígado se ha utilizado como modelo de hemorragia incontrolada, más comúnmente en modelos de ratas y porcinos, pero recientemente también en primates. ^{7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12} </suLos modelos murinos también han incorporado lesiones hepáticas, como un modelo de aplastamiento o un traumatismo cerrado; Sin embargo, estos modelos no resultan en choque hemorrágico secundario a la lesión hepática. ^{13 , 14}

Los modelos de hemorragia hepática no controlada por ratas y porcinos, aunque valiosos en la observación de prácticas de reanimación y monitorización hemodinámica, son menos ventajosos que un modelo murino por diversas razones, tales como el costo, el número de animales utilizados y lo importante es la falta relativa de líneas transgénicas disponibles para el análisis De señalización celular y molecular específica. El presente modelo murino comparte similitudes importantes con los modelos de hemorragia hepática existentes, incluyendo la laceración estandarizada del hígado, la cuantificación de la pérdida de sangre, el monitoreo hemodinámico y la capacidad para realizar el análisis de supervivencia. Muchos modelos existentes sólo incorporan algunos de estos aspectos mientras que nuestro modelo fue desarrollado para medir muchas de las variaciones fisiológicasBles simultáneamente y en ratones múltiples. Además, el desarrollo de un modelo murino abre la puerta a investigaciones más allá de la reanimación ya mecanismos fisiopatológicos más grandes en hemorragia incontrolada con el potencial de un modelo rentable y de alto rendimiento usando técnicas moleculares avanzadas.

Protocol

Los ratones se alojaron de acuerdo con las pautas de cuidado de animales de la Universidad de Pittsburgh (Pittsburgh, PA, EE.UU.) y de los Institutos Nacionales de Salud (NIH, Bethesda, MD, EUA) en condiciones libres de patógenos específicos con ciclos de luz y oscuridad de 12 h y libre acceso a Alimentación estándar y agua. Todos los experimentos con animales fueron aprobados y llevados a cabo de acuerdo con las directrices establecidas por el Animal Research and Care Committee en la Universidad de Pittsburgh. …

Representative Results

El modelo de laceración hepática produce una pérdida de sangre reproducible y consistente en ratones. La Figura 1A demuestra el peso consistente del hígado lacerado que se puede obtener con una desviación estándar de sólo 0,02 g. Esta consistencia en el peso del hígado lacerado permite la capacidad de reproducir el modelo entre los ratones y en diferentes configuraciones experimentales tales como diferentes protocolos de resucitación. Además, el peso reproducib…

Discussion

El modelo de laceración de hígado murino descrito aquí proporciona un modelo fiable y consistente de hemorragia no controlada. Este modelo es sencillo de realizar, pero hay pasos importantes que requieren consideración meticulosa. La parte más difícil técnicamente del modelo es la canulación de los vasos femorales para la monitorización hemodinámica y la administración de fluidos / fármacos. Se debe tener cuidado durante la disección del nervio y la arteriotomía / venotomía. Es importante no tocar el nerv…

Materials

SS/45 dumonts	Fine Science Tools	11203-25
surgical scissors	Fine Science Tools	14068-12
hemostats	Fine Science Tools	13009-12
microscissors	Fine Science Tools	15000-08
0.8mm curved forceps	Fine Science Tools	11009-13
suture reel 6-0	Fine Science Tools	18020-60
suture 4-0 silk w/ needle	Owens Minor	K188H
gauze 4×4	can be purchased through any global vendor
cotton-tip applicator	can be purchased through any global vendor
30G needle	can be purchased through any global vendor
23G needle	can be purchased through any global vendor
10cc syringe	can be purchased through any global vendor
50cc conical tube	can be purchased through any global vendor
1cc syringe w/ 25G needle	Fisher Scientific	14-826-88
Polyethylene 10 tubing 100`(PE-10)	Fisher Scientific	14-170-12P
Polyethylene 50 tubing 100`(PE-50)	Fisher Scientific	14-170-12B
3-way stopcock	Fisher Scientific	NC9779127
surgical blue pad	Fisher Scientific	50-7105
Sterile Field dressings	Fisher Scientific	NC9517505
tape rolls 1"	Corporate Express	MMM26001
straight side wide mouth jars	VWR	159000-058
stainless steel tray 8" x 11"	VWR	62687-049
male-male leur lock 3-way	VWR	20068-909
sterilization pouch 3"x8"	VWR	24008
sterilization pouch 5"x10"	VWR	24010
absorption triangles	Fine Science Tools	18105-03
7mm wound clip applier	Fisher Scientific	E0522687
1000 7mm wound clips	Fisher Scientific	E0522687
betadine (4oz)	can be purchased through any global vendor
sterile gloves	can be purchased through any global vendor
eppendorfs	can be purchased through any global vendor
1/2cc Lo-Dose insulin syringe	Fisher Scientific	12-826-79
small weigh boat	can be purchased through any global vendor
lactated ringers	can be purchased through any global vendor
hepranized saline solution (.1µ hep + 9.9µNaCl)	can be purchased through any global vendor
phosphate buffered saline	can be purchased through any global vendor
pentobarbital	can be purchased through any global vendor
Wild M650 microscope w/ boom stand	Leica
Digi-Med BPA-400 analyzer & systems integrator	Micro-Med	SYS-400
TXD-310 (Digi-Med Transducer)	Micro-Med	TXD-300
Computer	Dell
microbead instrument sterilizer	VWR	11156-002
Oster A5 clippers w. size 40 blade	VWR	10749-020
circulating heating pad 18×26	Harvard	py872-5272
rectal thermometer	Kent Scientific	RET-3