冷痛覚のための新規アッセイ<em>ショウジョウバエ</em>幼虫
Summary
ここでは、 ショウジョウバエの幼虫に冷たい痛覚を研究するための新規なアッセイを示しています。このアッセイは、焦点有害冷たい刺激を印加することが可能な特注のペルティエプローブを利用し、定量化可能な冷たい固有の動作になります。この技術は冷たい痛覚の更なる細胞および分子解剖を許可します。
Abstract
どのように生物が感知し、まだよく理解されている有害な温度に反応します。さらに、そのような末梢神経障害または損傷誘発性感を経験する患者のような感覚機械の感作を、基礎となるメカニズムは、十分に特徴付けられていません。遺伝的に扱いやすいショウジョウバエモデルは、有害な熱の検出に必要な細胞および遺伝子を研究するために使用されています これは、関心のある複数の保存された遺伝子が得られました。リトルは、細胞および有害な寒さの検出のための重要な受容体についてはしかし、知られています。 ショウジョウバエは、彼らが感知し、多分有害な冷たい刺激を避ける方法を、低温（≤10ºC）への長期暴露に耐えられないので、涼しい避けるだろう、行動好みアッセイにおける気温の上昇を好む、が、ごく最近研究されています。
ここでは、説明との最初の有害な寒さ（≤10ºC）の行動分析を特徴付けますショウジョウバエ。このツールおよびアッセイを使用して、我々は、定性的および定量的に冷たい侵害受容行動を評価するための方法を研究者を示しています。これは、通常の/健康な培養条件の下で、あるいはおそらく疾病、傷害または感作のコンテキストで行うことができます。さらに、このアッセイはthermosensation、疼痛、または侵害受容感に影響を与える可能性があり、所望の遺伝子型のために選択された幼虫に適用することができます。痛みはさらにそう脊椎動物を含む他の種の痛みプロセスの重要な理解を収集します熱痛覚を研究するために、このアッセイを用いて、高度に保存されたプロセスであることを考えます。
Introduction
ショウジョウバエは、新規保存された遺伝子と複合行動の根底にある神経回路の同定のため非常に有用であることが証明されています。ハエは、洗練された遺伝的ツールキットおよび痛覚5、6、7の細胞および分子の塩基を分析するために、正確な遺伝的および神経操作1、2、3、4を可能にする簡略化し、神経系を提供します。幼虫は、優しい肌触り8、9、10、有害な熱11、12、13及び侵害刺激4の機械的感覚のための行動アッセイことを考えると、これらの分析に特に有用です</sup> 11は 、既に確立されている、透明幼虫キューティクルは、表皮とその下にある感覚ニューロンのライブまたは固定のイメージングが可能になります。最近では、有害な寒さのためのアッセイはまた、我々は、ここでより詳細に説明7を 、開発されました。
罰金、円錐先端が冷たいプローブを使用して、我々は、 ショウジョウバエの幼虫が展示優しいタッチ、次の通常の歩行運動中に観察された行動とは別個の冷特有の反応行動のセットを、その、または過酷な機械的または高温刺激7、8、11の後に示して。冷たい固有の動作は、堅牢なフルボディの収縮（CT）、後部セグメント（PR）の45-90ºレイズとU字型（US）への前部と後部セグメントの同時昇給が含まれています。これらの行動の有病率は減少温度が、Sの各ピークに増加します軽く異なる低温。最近の研究は、CT応答が有害な熱や過酷な機械的刺激7に対応するものとは異なる末梢感覚ニューロンによって媒介されることを示唆しています。
多くの脊椎動物の侵害受容器のように、 ショウジョウバエの複数の樹状（MD）末梢感覚ニューロンは、表皮1の上にarborize複雑な樹枝状構造を有しています。 MDニューロンは、腹側神経索14への軸索を投射する、すべての幼虫の身体セグメント中に存在します。 MD感覚ニューロンは、樹状形態に基づいて、4つの異なるクラス（I-IV）に分離され、感覚機能4、9、10、15、16、17を変化しています。クラスIVニューロンは、幼虫の横車体ロール応答のために必要とされる一方で高温や過酷な機械的刺激4、クラスIIIニューロンは穏やかタッチ応答9、10のために必要とされるのみ冷によって活性化されていないだけでなく、冷誘発行動応答7のために必要とされます。両方のクラスIIIおよびクラスIVニューロンが刺激9、10、17、19 7、11、18侵害および非侵害に対する行動反応を促進するために、離散的一過性受容体電位（TRP）チャネルを利用します。さらに、幼虫侵害受容は、細胞20および行動レベル12、21で、次の傷害を感作されています。
ここに記載されるアッセイはquantificatioすることができます通常の、又は潜在的に周囲温度（18〜22ºC）に有害な冷（≤10ºC）の範囲の低温、無害クール（11-17ºC）に対する行動応答の改変のいずれかのN。このアッセイで使用される低温は、堅牢で再現性のカルシウムが増加し、定性的および定量7を分析することができる冷誘発行動応答を誘発する、直接クラスIII感覚ニューロンを活性化することができます。このアッセイは、実質的に任意の遺伝子型、ならびに冷痛覚、侵害受容感または侵害受容可塑性に影響を与える遺伝的および環境的双方の因子を決定するために、多様な環境条件（変更された栄養、傷害、薬理学的物質）に曝露された幼虫の幼虫に適用することができます。 thermosensationは、多くの種間でユビキタスであることを考えると、このアッセイは、痛覚の研究のための貴重なツールを提供し、新たな遺伝子標的または改善される神経細胞の相互作用を明らかにします脊椎動物痛覚の我々の理解。
特注コールドプローブは、（コールドプローブ、 材料の表を参照）、熱伝導を介してアルミニウム軸と円錐形先端を冷却する閉ループ温度制御されたペルチェ素子を利用します。アルミニウム円錐形先端は、制御ユニットにリアルタイムの温度を報告内部サーミスタが埋め込まれています。ヒートシンクとファン（熱制御ユニット、 材料の表を参照のこと）を達成することができるペルチェ効果の熱負荷（QC）は（22-0℃）での所望の温度範囲を調節するために、熱電モジュールに取り付けられています。コールドプローブ先端の有害な冷刺激が前方および後方端部から等距離セグメント（単数または複数）に、背側正中線に手で適用される幼虫の（おおよそセグメントA4、 図1Aを参照）。フルボディ：冷たい刺激に応答して、幼虫は、一般的に10秒のカットオフ内の3つの冷誘発行動の1を生産します収縮（CT）、U字状に前方および後方セグメントの45-90º昇給（US）、または（ 結果を参照）後部セグメント（PR）の昇給。これらの行動はいずれも正常な蠕動運動や採餌行動の間に実行されません。これらの挙動も優しいタッチレスポンスと高い温度や有害な機械的刺激に対する嫌悪ローリング応答とは区別されます。
Protocol
Representative Results
Discussion
ここに記載のアッセイは、定性的および定量的に様々な遺伝的背景、環境の影響、および/または損傷誘導条件の幼虫に痛覚または侵害受容感を評価するために使用することができます。このアッセイは冷刺激の焦点アプリケーションを可能にするため、このツールを使用すると、ワンは、特に低温に応答して、末梢感覚ニューロンのサブセットの機能を評価することができます。興味深いこ…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
私たちは、批判的に原稿を読み取るためのフライ株式、およびGalkoラボメンバーのために、ブルーミントンショウジョウバエストックセンターを冷たいプローブアッセイの初期段階を開発するためのサラ・ウーとカミラ・グラハム感謝します。この作品はHNTに、およびNIH R01NS069828、R21NS087360や基礎研究でテキサス大学MDアンダーソンクラークフェローシップによってMJGにNIH NRSA（NIH F31NS083306）によってサポートされていました。
Materials
| Cold Probe | Pro-Dev Engineering | Custom-built on demand | Part numbers and construction details can be provided on request |
| Thermal Control Unit | TE Technology | Custom Built enclosure | Part numbers and construction details can be provided on request |
| Zeiss Stemi 2000 microscope | Zeiss | NT55-605 | |
| Fiber-Lite MI-150 High Intensity Illuminator | Dolan-Jenner Industries. | A20500 | |
| Schott Dual Gooseneck 23 inch Fiber Optic Light Guide | Schott North America, Inc. | Schott A08575 | |
| Forceps | FST | FS-1670 | Used to sort and handle larvae. Be sure to smooth and blunt forceps tips slightly to lower the risk of accidently puncturing or injuring the larvae |
| Paintbrush | Dick Blick Art Materials | 06762-1002 | Used to sort and handle larvae. It is helpful if the paintbrush is damp during use. |
| 35 X 10 mm Polystyrene Petri Dish | Falcon | 351008 | |
| 60 X 10 mm Polystyrene Petri Dish | Falcon | 351007 | |
| Piece of black vinyl (at least 2 x 2 inches) | Used to provide contrast and orient larvae to the cold probe | ||
| Fisherbrand Scoopula Spatula | Fisher Scientific | 14-357Q | Used to move food |
| Kimtech Science Kimwipes | Fisher Scientific | 06-666A | Used to dry the larvae and cold probe if there is excess moisture |
References
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