Kirurgisk Ablation Assay for studere Eye Regeneration i planarier

Summary

Denne protokol viser, hvordan man konsekvent punktafgifter planarian øjne (optiske kopper) uden at forstyrre omgivende væv. Ved anvendelse af en insulin nål og sprøjte, enten den ene eller begge øjne kan ablateres at lette undersøgelser af mekanismer, der regulerer øje regenerering, udviklingen af ​​visuelle regenerering, og det neurale grundlag af lysinduceret adfærd.

Abstract

I undersøgelsen af voksne stamceller og regenerative mekanismer, planarian flatworms er en hæfteklamme in vivo modelsystem. Dette skyldes for en stor del af deres rigelige pluripotente stamceller befolkning og evne til at regenerere alle celle- og vævstyper efter skader, der ville være en katastrofe for de fleste dyr. For nylig har planarierne vundet popularitet som en model for øje regenerering. Deres evne til at regenerere hele øjet (bestående af to vævstyper: pigmentceller og fotoreceptorer) muliggør en dissektion af mekanismer, der regulerer visuelle system regenerering. Øje ablation har flere fordele frem for andre teknikker (såsom halshugning eller hulning) for at undersøge eye-specifikke veje og mekanismer, hvoraf de vigtigste er, at regenerering er stort set begrænset til øjenvæv alene. Formålet med denne video artikel er at vise, hvordan man pålideligt fjerner planarian optiske kop uden at forstyrre hjernen eller omgivende væv.Håndteringen af ​​orme og vedligeholdelse af en etableret koloni er også beskrevet. Denne teknik anvender en 31 G, 5/16 tommers insulin nål til kirurgisk øse ud af optiske kop planarierne immobiliseret på en kold plade. Denne metode omfatter både enkelt og dobbelt øje ablation, med øjne regenererende inden for 1-2 uger, hvilket muliggør en lang række anvendelser. Især kan denne ablation teknik let kombineres med farmakologiske og genetiske (RNA interferens) skærme for en bedre forståelse af regenerative mekanismer og deres udvikling, eye stamceller og deres vedligeholdelse og phototaxic adfærdsmæssige reaktioner og deres neurologiske basis.

Introduction

Planarierne er en kraftfuld model organisme til undersøgelse voksne stamceller cellemedieret regeneration. Disse ikke-parasitære ferskvands flatworms besidder evnen til at regenerere enhver og alle manglende væv, herunder det centrale nervesystem og hjerne ^1. Studeres som langt tilbage som 1700-tallet ^2, teknologiske fremskridt i planarian område i løbet af de sidste 10-15 år (såsom et genom, in situ hybridisering, immunhistokemi, RNA-interferens (RNAi), og transcriptomics) har opdateret denne historiske model organisme . Konkret har planarierne nylig vundet popularitet som en ny model for øje forskning ^3.

Planarierne har prototypiske øjne med kun to vævstyper, fotoreceptor neuroner og pigmentceller; dette har gjort det muligt karakteriseringen af ​​dets eye stem-cellepopulation og viste, at mange af de samme gener regulering hvirveldyr øje deling er konserveret i planarierne ^{4, 5.} De optiske adapter er placeret dorsalt og består af de hvide, upigmenterede dendritter af fotoreceptor neuroner og de semi-lunar sort pigmentceller, og øjnene innerverer hjernen via en optisk chiasm. Ud over at være en model til at belyse regenerative processer ^6, den planarian øje er velegnet til at studere udviklingen af visuelle mekanismer ^7, adfærdsmæssige reaktioner for lys (planarierne vise negativ phototaxis) ^8, og den neurologiske grundlag af adfærd ^9.

Øje regenerering i planarierne har i vid udstrækning undersøgt i to vigtigste sammenhænge: som en del af hoved regeneration efter halshugning ^{4, 10,} og efter udskæring af blot øjenvæv ^{11, 12} </sup>. Fleste planarian undersøgelser af øjet regenerering har brugt halshugning metode, som den er enkel og ligetil. Den mest almindelige planarian øje excision metode til dato været via hulning med en fin glas kapillarrør ^{13, 14,} selv om nogle undersøgelser også har udført amputationer lige bag øjnene (delvis decapitation) ^15. Men alle disse metoder involverer tab af andre end blot øjet mange væv (såsom hjerne, tarme, og nephridia), potentielt komplicerer fortolkning af resultaterne. Øjet ablation protokol præsenteres her begrænser udskæring til øjenvæv (specifikt ekskl hjernen), hvilket resulterer i data, som er mere specifikke for øjet. Derudover, i modsætning halshuggede orme, der tager 7-14 dage for at begynde fodringen, vil øjet ablateret orme foder inden 24 timer af ablation ^12, tillader RNAi forsøg (hvor RNAi leveres via fødevarer), der skal performed samtidigt.

Selvom øje ablation er teknisk sværere at kunne udføre end halshugning, har de nuværende undersøgelser med øje excision ikke inkluderet detaljerede instruktioner om deres procedurer. Målet med denne video artikel er at gøre det muligt for forskerne at konsekvent fjerne planarian optiske kop uden at forstyrre de underliggende hjernen væv og fjerne så få andre væv som muligt. Denne metode kan anvendes til både enkelt og dobbelt øje ablation og gælder for en lang række undersøgelser. Ligesom de fleste restitution assays øje ablation velegnet til kombination med både farmakologiske og genetiske (RNAi) skærme samt adfærdsmæssige undersøgelser. Her beskriver vi fremgangsmåder til håndtering af orme, at opretholde en planarian koloni, og øjet ablation teknik selv.

Protocol

1. Animalske Kultur og håndtering BEMÆRK: Denne protokol anvender Schmidtea mediterranea, en diploide planarian arter med en genom 16, 17, som er almindeligt anvendt til regenerering forskning. Men assayet er lige så vellykket med andre arter, såsom Girardia tigrina og Girardia dorotocephala (der er kommercielt tilgængelige). Opretholde orme i "orm vand" lavet fra 0,5 g / L…

Representative Results

For første 1-2 timer efter kirurgi, kan dyrene udviser nedsat bevægelighed i forhold til intakte orme (men de vil stadig bevæge). Hvis det ønskes, vil orme spise inden for 24 timer af kirurgi (for eksempel for RNAi fodring). Når følgende øjet regenerering i de samme individer over tid, Sørg for at tage et fotografi af hver orm både før kirurgi (intakt) og ved 1 h efter ablation (HPA). Ved 4 dage efter ablation (dpa) regenererende pigmentceller skal kunne ses, og med 14 dpa hele…

Discussion

Dette øje ablation teknik forbedrer de nuværende metoder (såsom hulning) ved at udelukke hjernevæv og begrænse udskæring hovedsagelig til øjenvæv. Med praksis, kan denne teknik udføres af de fleste individer, fra teknikere med erfaring i microsurgeries til uerfarne men samvittighedsfulde studerende. Det anbefales, at denne teknik praktiseres mange gange forud for anvendelse ablationer i eksperimenter, herunder (hvis muligt) en bekræftelse af fuldstændig fjernelse af alle øjenvæv ved immunhistokemi eller <em…

Materials

Instant Ocean sea salts	Spectrum Brands	SS15-10	"10 Gallon" box  (net weight 3 lbs)
Kimwipes EX-L lint-free tissue wipe	Kimberly-Clark	34155	4.5 x 8.5 in
Whatman #2 filter paper	Sigma	WHA1002125	Circles, 125 mm diameter, white
Easy Touch Insulin syringe (with needle)	Pet Health Market	17175-04	U-100 1 cc syringe, 31-gauge 5/16 in needle
100 mm Petri dish	VWR	25384-342	100 x 15 mm
60 mm Petri dish	VWR	25384-092	60 x 15 mm
Dumont #5  forceps	Fine Science Tools	11254-20	Inox, straight tip , 11 cm
Transfer pipettes	Samco Scientific	225	Graduated, large bulb, 7.5 mL, non sterile
Parafilm M paraffin film	Brand	701606	4 in x 125 ft roll
12-well untreated tissue culture plate	VWR	15705-059	Untreated, flat bottom, sterile, Falcon brand
Plastic food containers (for colony)	Ziploc	Large rectangle	2.25 qt (2.12 L), 10" x 6 -3/4 " x 3 -3/16"
Planaria (Girardia tigrina)	Carolina Biological	132954	Sold as "Brown" Planaria; most often they are G. tigrina (aka Dugesia tigrina), but sometimes are G. dorotocephala (aka Dugesia dorotocephala); either will work.
Planaria (Schmidtea mediterranea)	n/a	n/a	S. mediterranea are not commercially available. At this time animals are only obtainable from laboratories that use them and have extra animals.
Brown paper towels	Grainger	2U229	9-3/16 x 9-3/8" 1-Ply Multifold Paper Towel, UNBLEACHED
Wash bottle (for worm water), optional	VWR	16650-275	Wash Bottles, Low-Density Polyethylene, Wide Mouth, 500 mL
Anti-synapsin antibody, optional	Developmental Studies Hybridoma Bank	3C11	Supernatant
Anti-arrestin antibody, optional	n/a	n/a	Not commercially available. Kind gift from Michael Levin, Tufts University
Nalgene Lowboy carboy with spigot (for storing worm water), optional	Nalge Nunc International Corporation	2324-0015	15 L,  polypropylene, low profile makes it easier to fill plastic colony containers
Custom Peltier plate, optional	Williams Machine, Foxboro, MA	n/a	Design specifics courtesy of Junji Morokuma, Tufts University:  Peltier plate is constructed of a standard thermoelectric heat pump (for example, All Electronics Corp Catalog # PJT-1, 30 mm2).  The square heat pump is covered with a thin mirrored surface, then placed inside a 30 mm2 square hole in a circular plexiglass form (~50 mm in diameter). This form is of similar thickness to the heat pump, and fits flush into a well tooled in the center of a round heat sink (~115 mm in diameter). The form/heat pump is  "anchored" to the sink with silicone base heat sink compound. The leads are threaded through holes drilled through both the form and the the heat sink. The bottom half of the heat sink is tooled into a "foot" that fits into the opening of your microscope's base plate.
DC power source (for Peltier plate), optional	B & K Precision	1665	Regulated Low Voltage DC Power Supply, 1-18 volts (DC), 1-10 amps.
Other common supplies
Gloves
Razor blade
Scissors
Dissecting scope with gooseneck lighting
Chopstick rests, optional