Fluorescenza a tensione di serraggio in<em> Xenopus</em> Oociti che utilizzano aminoacidi innaturali fluorescenti
Summary
In questo articolo si descrive un miglioramento della convenzionale fluorometria a tensione di tensione (VCF) in cui vengono utilizzati fluorocinosi aminoacidi innaturali (fUAA) anziché coloranti maleimidi, per sondare i riarrangiamenti strutturali nei canali ionici. La procedura prevede l'iniezione di DNA Xenopus oocyte, la coinjection RNA / fUAA e le misure contemporanee di corrente e fluorescenza.
Abstract
La fluorometria a tensione di tensione (VCF) è stata la tecnica di scelta per studiare la struttura e la funzione delle proteine di membrana elettrogene dove le misurazioni in tempo reale di fluorescenza e correnti denunciano simultaneamente i riarrangiamenti locali e la funzione globale, rispettivamente 1 . Mentre le tecniche strutturali ad alta risoluzione come la microscopia crio-elettrona o la cristallografia a raggi X forniscono immagini statiche delle proteine di interesse, VCF fornisce dati strutturali dinamici che ci permettono di collegare i riarrangiamenti strutturali (fluorescenza) ai dati funzionali dinamici (elettrofisiologia). Fino a poco tempo fa, la chimica tiol-reattiva utilizzata per l'etichettatura fluorescente di proteine del sito ha limitato l'ambito dell'approccio perché tutte le cisteine accessibili, comprese quelle endogene, saranno etichettate. È stato pertanto necessario costruire proteine prive di cisteine endogene. L'etichettatura è stata anche limitata ai siti accessibili dall'estracellularelato. Ciò è cambiato con l'uso di fluidi naturali aminoacidi (fUAA) per incorporare specificamente una piccola sonda fluorescente in risposta alla soppressione del codone di arresto usando una coppia di tRNA e tRNA sintetasi ortogonale 2 . Il miglioramento del VCF richiede solo una procedura di iniezione in due fasi di iniezione del DNA (coppia tRNA / sintetasi) seguita da coinjection di RNA / fUAA. Ora, l'etichettatura di entrambi i siti intracellulari e sepolti è possibile, e l'uso di VCF è aumentato in modo significativo. La tecnica VCF diventa quindi attraente per studiare una vasta gamma di proteine e, soprattutto, consente di indagare numerosi meccanismi di regolazione citosolica.
Introduction
Oltre 200 aminoacidi innaturali di varie proprietà chimiche e fisiche sono state incorporate geneticamente in proteine in E. coli , cellule di lieviti e mammiferi 3 . L'aminoacido innaturale è incorporato in risposta a un codone di arresto specifico tramite una coppia tRNA / sintetasi ingegnerizzata ortogonale. L'approccio genetico per modificare le proteine ha fornito preziosi approfondimenti sulla struttura e funzione delle proteine. Qui presentiamo un protocollo per l'utilizzo della Fluorometria a Voltage-Clamp (VCF) in combinazione con un UAA fluorescente.
In VCF, l'osservazione simultanea di dati funzionali e riarrangiamenti strutturali localizzati intorno alla sonda fluorescente (~ 5 Å) ci consente di ottenere informazioni dinamiche con risoluzione milliseconda 1 . Le sonde fluorescenti alterano lo stato di spegnimento sul movimento localizzato della proteina. Un movimento di soli 1-2 Å è sufficiente a condurre a significativi cambiamenti nella fluorescenzaIntensità 4 . Dopo l'identificazione del sito di interesse nella proteina bersaglio, il sito è mutato dalla mutazione di punti. Classicamente, il residuo era stato mutato a una cisteina, mentre adesso è stato introdotto un codone di arresto ambrato (TAG) per l'incorporazione genica fUAA. La proteina viene poi trascritta in vitro .
Mentre altri sistemi di espressione possono essere utilizzati ( ad esempio, le cellule di mammiferi) 5 , 6 , 7 , gli oociti di Xenopus sono preferiti per gli studi di funzionalità della struttura a causa della loro dimensione più grande, portando a una manipolazione più facile e ad una maggiore intensità di fluorescenza (più fluorofori) Rapporto rumore. Inoltre, gli oociti di Xenopus hanno un basso livello di background dalle proteine endogene 2 , 8 e dalla pigmentazione scura sugli schermi polari animali contro la fluorescenza di fondo da tLui citosol. Gli oociti Xenopus vengono rimossi chirurgicamente e il DNA che codifica la coppia ortogonale tRNA / tRNA-sintetasi specifica per la fUAA viene iniettato nel nucleo degli oociti. Dopo un tempo di incubazione di 6-24 ore, l'RNA di proteina viene coinsidito con il fUAA nel citosolo degli oociti, seguito da un periodo di incubazione di 2-3 giorni. Per prevenire eventuali danni alla fUAA (fotoelettrodo), le procedure con Anap devono essere eseguite sotto luce rossa per evitare l'eccitazione del fluoroforo.
Gli oociti sono studiati su un dispositivo di tensione-bloccaggio di oocyte a taglio aperto, che viene montato su un microscopio a fluorescenza verticale e vengono registrati contemporaneamente 9 e 10 cambiamenti di corrente elettrica e fluorescenza. In alternativa, possono essere impiegate configurazioni di tensione 1 a bobina a due elettrodi o configurazioni di patch-clamp 11 . La fluorescenza è eccitata da lunghezze d'onda appropriate con rumore RMS basso e Emissione registrata utilizzando un fotodiodo collegato ad un amplificatore ad alta amplificazione.
Ci sono diversi vantaggi dell'utilizzo di aminoacidi innaturali fluorescenti (fUAA) in fluorometria a tensione. Uno è l'accesso al lato citosolico delle proteine della membrana; Si trovano qui molti processi regolatori ( ad esempio, siti di legame di Ca 2+ o nucleotidi, inattivazione rapida e in stato di stato dei canali ionici a tensione, apertura dei pori, accoppiamento dei moduli). Tutti questi processi sono ora accessibili per l'etichettatura fluorescente.
Un altro vantaggio è la piccola dimensione della sonda che porta a meno disturbi della proteina. Finora, due coppie ortogonali di sintetasi tRNA / tRNA per fUAA sono state progettate 12 , 13 , dove l'acido 3- (6-acetilnaftalen-2-ilamino) -2-aminopropanoico (Anap) è l'unica fUAA che è stata utilizzata negli oociti Xenopus 2 ,"Xref"> 8. Anap è un fluoroforo sensibile all'ambiente con un peso molecolare di 272,3 g / mol ed è solo leggermente più grande del triptofano 12 ( figure 1A, 1B ). A causa della sua dimensione ridotta, probabilmente saranno meno gli effetti sterici da parte del fluoroforo rispetto ai fluorofori convenzionali collegati tramite un linker (tipicamente più di 500 g / mol). Inoltre, nel caso di Anap, il fluoroforo si trova più vicino alla base proteica rispetto a quelli legati alle cisteine, e di conseguenza, Anap sta sondando ulteriori riarrangiamenti localizzati. Infine, la rimozione di cisteine endogene nel VCF convenzionale per garantire che l'etichettatura specifica del sito non sia più un requisito in UAA-VCF e quindi (i) lascia le proteine in (quasi) il loro stato nativo e (ii) consente di applicare VCF Per studiare una gamma più ampia di proteine in cui la funzione può essere alterata dalla sostituzione di cisteina.
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Figura 1 : Anap e Fluorescenza Spectra. ( A ) Struttura chimica di Anap. ( B ) Spettri di assorbimento normalizzati e spettri di emissione per 1 nM Anap, dimostrando la sensibilità della fluorescenza Anap all'idropobicità del solvente. Gli spettri di emissione sono stati ottenuti emozionanti a 350 nm. Clicca qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Uno svantaggio dell'utilizzo di UAA fluorescenti è che una popolazione eterogenea di proteine può derivare dalla riduzione del codone di arresto, dalla reinitiazione della traslazione, dalle proteine troncate del C-terminale o dalla crisi con l'aminoacilazione endogena se la quantità di tRNA aminoacilati è scarsa. Tale espressione di perdita deve sempre essere controllata in assenza della fUAA e della coppia di sintesi tRNA / tRNA. Abbiamo affrontato la questione del transReinitiation lancinante e come eluderlo per i siti di inserimento del terminale N in precedenza 14 . Tuttavia, quando la fUAA, la tRNA e la tRNA sintetasi sono presenti in quantità saturate, rimane solo una bassa probabilità di espressione di perdita.
La differenza procedurale tra fUAA-VCF e VCF convenzionale è l'iniezione e la manipolazione degli ovociti; L'iniezione di DNA che codifica il tRNA e la sintetasi tRNA (pAnap) è seguita dall'introduzione di Anap, che viene co-iniettato con la proteina mRNA o aggiunta alternativamente alla soluzione di incubazione come estere acetossimetil (AM).
Protocol
Representative Results
Discussion
L'aminoacilazione in vivo di tRNAs che vengono continuamente trascritti insieme alla sintetasi tRNA, consente di ottenere livelli elevati di espressione per le misurazioni di fluorescenza. Per l'efficace incorporazione fUAA, è fondamentale che pAnap sia iniettato correttamente nel nucleo. A causa dell'incertezza della posizione esatta del nucleo, 10-40% delle iniezioni del DNA dovrebbero fallire, causando oociti non esprimenti (o esprimendo perdite). Pertanto, è importante controllare l'espres…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
PAnap è stato un regalo gentile del Dr. Peter Schultz (Scripps Research Institute). Questo lavoro è stato finanziato dagli istituti canadesi per i finanziamenti di ricerca sanitaria MOP-102689 e MOP-136894 (a RB) e la Fondazione canadese per l'innovazione 950-225005.
Materials
| Solutions | |||
| Barth's solution | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | S7653 | 90mM |
| KCl | Fisher Scientific | BP366-500 | 3mM |
| MgSO4 | Sigma-Aldrich | M-9397 | 0.82mM |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C-7902 | 0.41mM |
| Ca(NO3)2 | Sigma-Aldrich | C-1396 | 0.33mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 5mM |
| NaOH hydrate | BDH | BDH7225-4 | pH 7.6 |
| Penicilin | Invitrogen | 15140122 | 100U/mL |
| Streptomycin | Invitrogen | 15140122 | 100µg/mL |
| Kanamycin | Invitrogen | 15160054 | 10mg/100mL |
| Horse serum | Invitrogen | 16050122 | 5% |
| SOS Standard Oocyte Solution | |||
| NaCl | Sigma-Aldrich | 746398 | 102 mM |
| KCl | Sigma-Aldrich | 746436 | 3 mM |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | M9272 | 1 mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 5 mM |
| External recording solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Alfa Aesar | L14282 | 115mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10mM |
| Calcium hydroxide | Sigma-Aldrich | 239232 | 2mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| Internal recording solution | |||
| N-methyl-D-glucamine (NMDG) | Alfa Aesar | L14282 | 115mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10mM |
| Ethylenediamine Tetraacetic Acid (EDTA) | Fisher Scientific | E478-500 | 2mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| Labeling solution | |||
| KOH | Fisher Scientific | P250-1 | 115mM |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | 10mM |
| Calcium hydroxide | Sigma-Aldrich | 239232 | 2mM |
| MES hydrate | Sigma-Aldrich | 258105 | pH 7.2 |
| TMR stock solution | |||
| Tetramethylrhodamine-5-maleimide (TMR) | Molcular Probes by Life Technologies | T6027 | 5mM in DMSO |
| Anap stock solution | |||
| Anap | ABZENA (TCRS) | Custom synthesis TCRS-170 | 1mM in nuclease-free water and 1% NaOH 1N |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Material/Equipment | |||
| pAnap | Addgene | 48696 | |
| High Performance Oocyte Clamp | Dagan Corporation | CA-1B | |
| Gpatch Acquisition software | Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles | ||
| Analysis software | Department of Anesthesiology, University of California, Los Angeles | ||
| Recording Chamber | Custom machined | ||
| Photo diode detection system | Dagan Corporation | PhotoMax-200/PIN | |
| Electrical shutter driver | UNIBLITZ | VCM-D1 | |
References
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