Høj opløsning Imaging og analyse af de enkelte Astral mikrotubulusdynamik i Spirende Gær
Summary
Knopskydende gær er et fordelagtigt model til undersøgelse mikrotubulusdynamik in vivo på grund af sin stærke genetik og dens enkle mikrotubuluscytoskelettet. Den følgende protokol beskriver, hvordan man omdanne og kultur gærceller, erhverve konfokal mikroskopi billeder, og kvantitativt analysere mikrotubulusdynamik i levende gærceller.
Abstract
Dynamiske mikrotubuli er fundamentale for mange cellulære processer, og nøjagtige målinger af mikrotubulusdynamik kan give indsigt i, hvordan celler regulerer disse processer og hvordan genetiske mutationer indvirkning regulering. Kvantificeringen af mikrotubulusdynamik i metazoiske modeller har en række tilknyttede udfordringer, herunder en høj mikrotubulus tæthed og begrænsninger i genetiske manipulationer. I modsætning hertil spirende gærmodel giver fordele, der kan overvinde disse udfordringer. Denne protokol beskriver en fremgangsmåde til at måle dynamikken i enkelte mikrotubuli i levende gærceller. Celler, der udtrykker fluorescensmærkede tubulin overholdes samles gliderkamre, hvilket muliggør stabil time-lapse billede erhvervelse. En detaljeret guide til højhastighedstog, er fire-dimensionelle billede erhvervelse også tilvejebragt, samt en protokol til kvantificering egenskaberne af dynamiske mikrotubuli i konfokale billedstakke. Denne fremgangsmåde kombineret med konventionelle gærgenetik, provIdes en tilgang, der er unikt egnet til kvantitativ vurdering af virkningerne af mikrotubuli regulatorer eller mutationer, der ændrer aktiviteten af tubulin underenheder.
Introduction
Mikrotubuli er cytoskelet polymerer fremstillet af ap-tubulin proteinunderenheder og anvendes i en lang række af cellulære sammenhænge, herunder intracellulær transport, celledeling, morfogenese, og motilitet. At opbygge mikrotubuli netværk til disse forskellige roller, skal cellerne omhyggeligt regulerer, hvor og hvornår mikrotubuli formular. Denne regulering opnås ved styring af reaktioner, som enten samle ap-tubulin underenheder i mikrotubuli polymerer eller adskille mikrotubuli til frie underenheder; dette er kendt som mikrotubulusdynamik.
Et vigtigt mål for mikrotubulus felt er at belyse de molekylære mekanismer, der regulerer mikrotubulusdynamik, herunder undersøgelser af ap-tubulin underenheder og ydre regulatorer, der binder til tubulin og / eller til mikrotubuli. En veletableret eksperimentelle fremgangsmåde er at rekonstituere dette system in vitro ved anvendelse af oprenset αβ-tubulin protein, ofte i comkombination med oprensede ydre regulatorer. Selv om dette er en nyttig fremgangsmåde, er det klart, at mikrotubulusdynamik i rekonstruerede systemer afviger kraftigt fra den, der observeres i levende celler. For eksempel mikrotubuli vokser hurtigere og krymper langsommere in vivo end in vitro. Disse forskelle kan tilskrives tilgængeligheden af kendte ydre regulatorer 1, samt endnu-udefinerede faktorer i celler. Derfor er det kritisk at bestemme aktiviteter mikrotubuli regulatorer og mutanter, der forstyrrer dynamik i en nativ cellulær sammenhæng.
Selvom metazo modeller har vist sig at være de fremherskende systemer til undersøgelse mikrotubulusfunktion og højere ordens organisation, adskillige praktiske betænkeligheder alvorligt begrænse anvendeligheden af disse modeller til præcis måling af mikrotubulusdynamik. Først det store antal af mikrotubuli, der spænder fra snesevis til tusindvis per celle, gør det vanskeligt at trygtspore individuelle mikrotubuli over tid. Mange undersøgelser tage denne udfordring af imaging proteiner, der selektivt lokaliserer til mikrotubuli ender, såsom proteiner i slutningen-binding (EB) familie. Imidlertid er disse proteiner vides at kun lokalisere til enderne af voksende mikrotubuli i metazoans 2. Derfor er anvendeligheden af disse proteiner begrænset til direkte måling vækstrater, mens kun indirekte måling af andre aspekter af dynamik, som hyppigheden af katastrofe. For det andet, på trods af fremskridt i genom redigering teknologi, skabe celler, der stabilt udtrykker fluorescerende mærket tubulin eller indfører mutationer til selektivt manipulere tubulin eller mikrotubuli regulatorer er fortsat en stor udfordring. Desuden er tilstedeværelsen af mange tubulin isotyper i metazoans forvirrer studiet af hvordan mutationer påvirke individuelle tubulingener.
Den knopskydende gær system giver flere vigtige fordele til måling in vivo microtubule dynamik. Gær har en forenklet mikrotubuli netværk, der tillader visualisering af individuelle mikrotubuli. I gær mikrotubuli hidrører fra tilrettelæggelse centre kendt som spindelpol organer (SPBs), der er indlejret i kernekappen 3. De SPBs tjene som scaffolds for y-tubulin små komplekser, der nucleate mikrotubuli 4, 5. SPBs kim to klasser af mikrotubuli, spindel mikrotubuli og astrale mikrotubuli. Spindel mikrotubuli rager ind nukleoplasmaet og er vigtige for fastgørelse til kromosomer via kinetochoren mikrotubuli og til stabilisering af spindlen via overlappende interpolar mikrotubuli 6. I modsætning hertil er astrale mikrotubuli projekt udad ind i cytosolen og relativt sjældne i forhold til det tætte net af spindel mikrotubuli. Under mitose, præ-anafase celler har kun 1-2 astrale mikrotubuli udgår fra enten SPB; disse findes som jegndividual mikrotubuli snarere end som bundter 7. Rollen af astrale mikrotubuler under mitose er at bevæge kernen og spindlen ind i overgangen mellem mor og bud rum, kendt som knop hals. Denne bevægelse involverer veldefinerede veje, der genererer kraft på astrale mikrotubuler, trækker kernen og spindlen hen imod og til sidst ind i knop hals 8.
En anden fordel ved gær-systemet er nytten af sine genetik, som kan bruges til at undersøge mikrotubuli regulatorer og tubulin underenheder med uovertruffen præcision. Gær også besidder en forenklet repertoire af tubulin isotyper: en enkelt β-tubulin-genet (TUB2) og to a-tubulin-gener (TUB1 og TUB3). Mutationer kan let indføres i disse gener og derved undersøgt i en homogen tubulin population 9, 10. Der er en række af vidttilgængelige konstruktioner til mærkning mikrotubuli, og disse kan målrettes til integration ved kromosomale loci til stabil ekspression (se Diskussion).
Det overordnede mål med denne metode er at billeddata enkelt mikrotubuli i levende gærceller i fire dimensioner (X, Y, Z, og T) til høj opløsning målinger af mikrotubulusdynamik. Metoder til integrering konstrukter for den konstitutive, lavt niveau ekspression af fluorescensmærket tubulin i gærceller er beskrevet. Før billeddannelse, er levende celler monteret i gliderkamre coatet med lectin Concanavalin A at stabilisere cellerne for langsigtet billeddannelse. De optimale parametre for erhvervelse billede, samt et workflow til dataanalyse, er også beskrevet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den spirende gær model tilbyder store fordele til indsamling af målinger i høj opløsning af mikrotubulusdynamik i en in vivo indstilling, herunder evnen til at billedet enkelt mikrotubuli over tid og evnen til at manipulere tubuliner og mikrotubuli regulatorer ved hjælp af værktøjerne i gær genetik.
De Concanavalin A-overtrukne kamre giver et antal fordele i forhold til tidligere beskrevne apparater, herunder smeltet agar pads. Objektglassene med kamre kan præ-made og opbev…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Kerry Bloom (University of North Carolina), Kyung Lee (NCI), Steven Markus (Colorado State University) og Elmar Schiebel (Universität Heidelberg) til deling af forskellige FP-TUB1 plasmider. Vi er taknemmelige for Melissa Gardner (University of Minnesota) til at træne os i slide kammer fremstillingsmetoden. Dette arbejde blev støttet af National Institutes of Health (NIH) give R01GM112893-01A1 (til JKM) og T32GM008730 (CE).
Materials
| DOB (dropout bases) | Sunrise science | 1650 | |
| CSM-Leu | Sunrise science | 1005 | |
| Agar | Ameresco | N833 | |
| 100mm polystyrene plates | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| ssDNA (Samon Sperm) in sterile DiH2O | Sigma-Aldrich | D7656 | resuspend at 10 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC |
| Synthetic Complete Media | Sunrise science | 1459-100 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | L7647 | resuspend at 2 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| Microscope Coverslips | Fisher Scientific | 12-541-B | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | paraffin film |
| VALAP (Equal parts of Vaseline, lanolin and paraffin) | melt at 75 ºC before use | ||
| forceps | Fisher Scientific | 16-100-106 | |
| Poyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma-Aldrich | 202444 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | |||
| Ti E inverted Perfect Focus microscope | Nikon Instruments | MEA53100 | |
| 1.45 NA 100x CFI Plan Apo objective | Nikon Instruments | MRD01905 | |
| Piezo electric stage | Physik Instrumente | P-736 | |
| Spinning disk scanner | Yokogawa | CSU10 | |
| Laser combiner module | Agilent Technologies | MCL400B | |
| EMCCD camera | Andor Technology | iXon Ultra 897 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elements software | Nikon Instruments | MQS31100 | |
| Microsoft Excel software | Microsoft | ||
| MATLAB software | MathWorks, Inc | ||
| ImageJ64 | NIH | Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| Bio-Formats Importer plug-in | Open Microscopy Environment | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pUC19-LEU2::GFP-TUB1 | pSK1050 | reference: Song, S. and Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001) |
References
- Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels. Nat Cell Biol. 15 (6), 688-693 (2013).
- Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules. Curr Biol. 10 (14), 865-868 (2000).
- Byers, B., Goetsch, L. Behavior of spindles and spindle plaques in the cell cycle and conjugation of Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol. 124 (1), 511-523 (1975).
- Marschall, L. G., Jeng, R. L., Mulholland, J., Stearns, T. Analysis of Tub4p, a yeast gamma-tubulin-like protein: implications for microtubule-organizing center function. J Cell Biol. 134 (2), 443-454 (1996).
- Spang, A., Geissler, S., Grein, K., Schiebel, E. gamma-Tubulin-like Tub4p of Saccharomyces cerevisiae is associated with the spindle pole body substructures that organize microtubules and is required for mitotic spindle formation. J Cell Biol. 134 (2), 429-441 (1996).
- Winey, M., Bloom, K. Mitotic spindle form and function. Genetics. 190 (4), 1197-1224 (2012).
- Gupta, M. L. J., et al. beta-Tubulin C354 mutations that severely decrease microtubule dynamics do not prevent nuclear migration in yeast. Mol Biol Cell. 13 (8), 2919-2932 (2002).
- Moore, J. K., Cooper, J. A. Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex. Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).
- Gartz Hanson, M., et al. Novel alpha-tubulin mutation disrupts neural development and tubulin proteostasis. Dev Biol. 409 (2), 406-419 (2016).
- Fees, C. P., Aiken, J., O’Toole, E. T., Giddings, T. H. J., Moore, J. K. The negatively charged carboxy-terminal tail of beta-tubulin promotes proper chromosome segregation. Mol Biol Cell. 27 (11), 1786-1796 (2016).
- Song, S., Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001).
- Knop, M., et al. Epitope tagging of yeast genes using a PCR-based strategy: more tags and improved practical routines. Yeast. 15 (10B), 963-972 (1999).
- Kosco, K. A., et al. Control of microtubule dynamics by Stu2p is essential for spindle orientation and metaphase chromosome alignment in yeast. Mol Biol Cell. 12 (9), 2870-2880 (2001).
- Toso, R. J., Jordan, M. A., Farrell, K. W., Matsumoto, B., Wilson, L. Kinetic stabilization of microtubule dynamic instability in vitro by vinblastine. Biochemistry. 32 (5), 1285-1293 (1993).
- Aiken, J., Sept, D., Costanzo, M., Boone, C., Cooper, J. A., Moore, J. K. Genome-wide analysis reveals novel and discrete functions for tubulin carboxy-terminal tails. Curr Biol. 24 (12), 1295-1303 (2014).
- Straight, A. F., Marshall, W. F., Sedat, J. W., Murray, A. W. Mitosis in living budding yeast: anaphase A but no metaphase plate. Science. 277 (5325), 574-578 (1997).
- Khmelinskii, A., Lawrence, C., Roostalu, J., Schiebel, E. Cdc14-regulated midzone assembly controls anaphase B. J Cell Biol. 177 (6), 981-993 (2007).
- Markus, S. M., Omer, S., Baranowski, K., Lee, W. L. Improved Plasmids for Fluorescent Protein Tagging of Microtubules in Saccharomyces cerevisiae. Traffic. 16 (7), 773-786 (2015).
