Ad alta risoluzione Imaging e analisi dei singoli microtubuli astrali Dynamics in germogliamento lievito
Summary
Erba lievito è un modello vantaggioso per lo studio della dinamica dei microtubuli in vivo grazie ai suoi potenti genetica e la semplicità della sua citoscheletro microtubuli. Il seguente protocollo descrive come trasformare le cellule e la cultura di lievito, di acquisire immagini di microscopia confocale, e quantitativamente analizzare dinamica dei microtubuli in cellule di lievito viventi.
Abstract
microtubuli dinamiche sono fondamentali in molti processi cellulari, e misurazioni accurate della dinamica dei microtubuli possono fornire informazioni su come le cellule regolano questi processi e come mutazioni genetiche regolazione impatto. La quantificazione della dinamica dei microtubuli in modelli metazoi ha un certo numero di problemi connessi, compresi una densità microtubuli elevato e limitazioni manipolazioni genetiche. Al contrario, il modello di lievito in erba offre vantaggi che superano queste sfide. Questo protocollo descrive un metodo per misurare la dinamica dei singoli microtubuli in cellule di lievito viventi. Cellule che esprimono tubulina fluorescente contrassegnati sono rispettate camere di scorrimento assemblate, consentendo l'acquisizione di immagini time-lapse stabile. Una guida dettagliata per l'alta velocità, è prevista anche l'acquisizione di immagini a quattro dimensioni, così come un protocollo per quantificare le proprietà dei microtubuli dinamiche in pile di immagine confocale. Questo metodo, combinato con la genetica del lievito convenzionali, providi un approccio che è particolarmente adatto per valutare quantitativamente gli effetti regolatori microtubuli o mutazioni che alterano l'attività di subunità di tubulina.
Introduction
I microtubuli sono polimeri del citoscheletro fatti di subunità proteiche αβ-tubulina e sono utilizzati in un'ampia varietà di contesti cellulari, compreso il trasporto intracellulare, la divisione cellulare, morfogenesi, e la motilità. Per costruire reti microtubuli per questi ruoli diversi, le cellule devono regolamentare con attenzione dove e quando modulo di microtubuli. Questa regolazione viene eseguita per mezzo di reazioni che o assemblare subunità αβ-tubulina in microtubuli polimeri o microtubuli smontare in subunità liberi; questo è noto come dinamica dei microtubuli.
Uno degli obiettivi principali del campo microtubulo è quello di chiarire i meccanismi molecolari che regolano dinamica dei microtubuli, compresi quelli di subunità αβ-tubulina e regolatori estrinseci che si legano alla tubulina e / o ai microtubuli. Un approccio sperimentale consolidata a ricostituire questo sistema in vitro utilizzando proteine αβ-tubulina purificata, spesso in comcombinazione con regolatori estrinseci purificati. Anche se questo è un approccio utile, è chiaro che la dinamica dei microtubuli in sistemi ricostituito, differisce notevolmente da quella osservata nelle cellule viventi. Ad esempio, microtubuli crescono più rapidamente e si restringono più lento in vivo che in vitro. Queste differenze possono essere attribuite alla disponibilità di noti regolatori estrinseci 1, nonché a fattori ancora-non definiti nelle cellule. Pertanto, è fondamentale per determinare le attività dei regolatori microtubuli e mutanti che interrompono la dinamica in un contesto cellulare nativo.
Sebbene i modelli metazoi hanno dimostrato di essere i sistemi prevalenti per studiare la funzione dei microtubuli e l'organizzazione di ordine superiore, diversi problemi pratici limitano fortemente l'utilità di questi modelli per la misura precisa della dinamica dei microtubuli. In primo luogo, l'elevato numero di microtubuli, che vanno da decine di migliaia per cella, rende difficile la fiduciamonitorare i singoli microtubuli nel corso del tempo. Molti studi affrontare questa sfida di imaging proteine che localizzano selettivamente estremità microtubuli, come le proteine della famiglia di fine-binding (EB). Tuttavia, queste proteine sono noti per localizzare solo alle estremità di crescita microtubuli in metazoi 2. Pertanto, l'utilità di queste proteine è limitato a misurare direttamente tassi di crescita, mentre solo misurando indirettamente altri aspetti della dinamica, come la frequenza di catastrofe. In secondo luogo, nonostante i progressi nella tecnologia di editing genoma, la creazione di cellule che esprimono stabilmente tubulina fluorescente o l'introduzione di mutazioni di manipolare selettivamente tubulina o microtubuli regolatori rimane una sfida significativa. Inoltre, la presenza di molti isotipi di tubulina in metazoi confonde lo studio di come le mutazioni impatto singoli geni di tubulina.
Il sistema lievito erba fornisce diversi vantaggi importanti per la misurazione in vivo microtubudinamiche LE. Lievito ha una rete microtubuli semplificata che permette la visualizzazione dei singoli microtubuli. Nel lievito, microtubuli provengono dall'organizzazione centri noti come corpi polari mandrino (DSF), che sono incorporati nella membrana nucleare 3. I SPB servono come supporti per piccoli complessi y-tubulina che nucleata microtubuli 4, 5. SPB nucleazione due classi di microtubuli, microtubuli del fuso e microtubuli astrali. Microtubuli del fuso progetto in nucleoplasma e sono importanti per applicazione cromosomi via microtubuli cinetocoro e per stabilizzare il mandrino mediante sovrapposizione microtubuli interpolari 6. Al contrario, progetto microtubuli astrali verso l'esterno nel citosol e sono relativamente rari rispetto alla fitta rete di microtubuli del fuso. Durante la mitosi, cellule pre-anafase hanno solo 1-2 microtubuli astrali provenienti da entrambi SPB; questi esistono come imicrotubuli lcune piuttosto che come fasci 7. Il ruolo dei microtubuli astrali durante la mitosi è quello di spostare il nucleo e il mandrino nella giunzione tra la madre e germoglio compartimenti, noto come il collo bocciolo. Questo movimento comporta percorsi ben definiti che generano vigore microtubuli astrali, tirando il nucleo e il mandrino verso e infine nel collo germoglio 8.
Un altro vantaggio del sistema lievito è l'utilità della sua genetica, che possono essere utilizzati per studiare i regolatori microtubuli e subunità di tubulina con precisione senza precedenti. Lievito possiedono anche un repertorio semplificata di isotipi di tubulina: un unico β-tubulina gene (TUB2) e due geni alfa-tubulina (tub1 e TUB3). Le mutazioni possono essere facilmente introdotti in questi geni e quindi studiati in una popolazione omogenea tubulina 9, 10. Ci sono una serie di ampiamentecostrutti disponibili per microtubuli di etichettatura, e questi possono essere oggetto di integrazione a cromosomica loci per l'espressione stabile (vedi la discussione).
L'obiettivo generale di questo metodo è quello di immagini singole microtubuli in cellule di lievito residente a quattro dimensioni (X, Y, Z, e T) di misura ad alta risoluzione della dinamica dei microtubuli. Metodi per integrare costrutti per la costitutiva, basso livello di espressione di tubulina fluorescente in cellule di lievito sono descritti. Prima di imaging, cellule viventi sono montati in camere di scorrimento rivestite con lectina concanavalina A per stabilizzare le cellule per l'imaging a lungo termine. I parametri ottimali per l'acquisizione delle immagini, nonché un flusso di lavoro per l'analisi dei dati, sono anche descritti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il modello lievito gemmante offre importanti vantaggi per la raccolta di misurazioni ad alta risoluzione della dinamica dei microtubuli in un ambiente in vivo, compresa la capacità di immagini singole microtubuli nel tempo e la capacità di manipolare tubuline e regolatori microtubuli utilizzando gli strumenti della genetica del lievito.
Le camere Concanavalina A-patinata forniscono un certo numero di vantaggi rispetto apparati precedentemente descritti, tra pastiglie fuso agar. Ve…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ringraziamo Kerry Bloom (University of North Carolina), Kyung Lee (NCI), Steven Markus (Colorado State University), e Elmar Schiebel (Universität Heidelberg) per la condivisione di vari plasmidi FP-tub1. Siamo grati a Melissa Gardner (University of Minnesota) per noi la formazione nel metodo di preparazione camera di scorrimento. Questo lavoro è stato sostenuto dal National Institutes of Health (NIH) concedere R01GM112893-01A1 (a JKM) e T32GM008730 (a CE).
Materials
| DOB (dropout bases) | Sunrise science | 1650 | |
| CSM-Leu | Sunrise science | 1005 | |
| Agar | Ameresco | N833 | |
| 100mm polystyrene plates | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| ssDNA (Samon Sperm) in sterile DiH2O | Sigma-Aldrich | D7656 | resuspend at 10 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC |
| Synthetic Complete Media | Sunrise science | 1459-100 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | L7647 | resuspend at 2 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| Microscope Coverslips | Fisher Scientific | 12-541-B | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | paraffin film |
| VALAP (Equal parts of Vaseline, lanolin and paraffin) | melt at 75 ºC before use | ||
| forceps | Fisher Scientific | 16-100-106 | |
| Poyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma-Aldrich | 202444 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | |||
| Ti E inverted Perfect Focus microscope | Nikon Instruments | MEA53100 | |
| 1.45 NA 100x CFI Plan Apo objective | Nikon Instruments | MRD01905 | |
| Piezo electric stage | Physik Instrumente | P-736 | |
| Spinning disk scanner | Yokogawa | CSU10 | |
| Laser combiner module | Agilent Technologies | MCL400B | |
| EMCCD camera | Andor Technology | iXon Ultra 897 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elements software | Nikon Instruments | MQS31100 | |
| Microsoft Excel software | Microsoft | ||
| MATLAB software | MathWorks, Inc | ||
| ImageJ64 | NIH | Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| Bio-Formats Importer plug-in | Open Microscopy Environment | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pUC19-LEU2::GFP-TUB1 | pSK1050 | reference: Song, S. and Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001) |
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