Høyoppløselig avbildning og analyse av enkelt Astral mikrotubulidynamikk i Budding gjær
Summary
Spirende gjær er en fordelaktig modell for å studere mikrotubulidynamikk in vivo på grunn av sin kraftige genetikk og enkelheten mikrotubuli-cytoskjelettet. Følgende protokoll beskriver hvordan å transformere og kulturgjærceller, erverve konfokale mikroskopi bilder, og kvantitativt å analysere mikrotubulidynamikk i levende gjærceller.
Abstract
Dynamiske mikrotubuli er grunnleggende for mange cellulære prosesser, og nøyaktige målinger av mikrotubulidynamikk kan gi innsikt i hvordan cellene regulere disse prosesser, og hvor genetiske mutasjoner innvirkning regulering. Kvantifiseringen av mikrotubulidynamikk i metazo modeller har en rekke utfordringer i forbindelse, blant annet en høy tetthet mikrotubuli og begrensninger på genetiske manipulasjoner. I kontrast til den spirende gjær modellen gir fordeler som overvinne disse utfordringene. Denne protokollen beskriver en metode for å måle dynamikken av enkelte mikrotubuli i levende gjærceller. Celler som uttrykker fluorescensmerket tubulin er klebet til sammen glidekammere, slik at for stabil time-lapse bildeopptak. En detaljert guide for høy hastighet, blir fire-dimensjonale bildeinnsamling bringes også så vel som en protokoll for kvantifisering av egenskapene til dynamiske mikrotubuli i konfokalt bilde stabler. Denne fremgangsmåten, kombinert med konvensjonelle Yeast Genetics, provides en tilnærming som er unikt egnet for kvantitativt å vurdere effektene av mikrotubuli-regulatorer eller mutasjoner som endrer aktiviteten av tubulin subenheter.
Introduction
Mikrotubuli er cytoskeletale polymerer fremstilt av ap-tubulin protein subenheter og anvendes i en rekke forskjellige cellulære sammenhenger, inkludert intracellulær transport, celledeling, morfogenese, og motilitet. Å bygge mikrotubulidynamikk nettverk for disse ulike rollene, må cellene nøye regulere hvor og når mikrotubuli form. Denne regulering oppnås ved å styre reaksjonene som enten montere aB-tubulin-subenhetene til mikrotubuli-polymerer eller demontere mikrotubuli til frie underenheter; Dette er kjent som mikrotubulidynamikk.
Et hovedmål med mikrotubuli-feltet er å belyse de molekylære mekanismene som regulerer mikrotubul-dynamikk, inkludert studier av ap-tubulin underenheter og ytre regulatorer som binder seg til tubulin og / eller til mikrotubuli. En godt etablert eksperimentell tilnærming er å rekonstituere dette system in vitro ved anvendelse av renset tubulin αβ-protein, ofte i comsjonen fast med rensede ytre regulatorer. Selv om dette er en nyttig tilnærming, er det klart at mikrotubulidynamikk i rekonstituert systemer skiller seg sterkt fra det som ble observert i levende celler. For eksempel, mikrotubuli vokse raskere og langsommere krympe in vivo enn in vitro. Disse forskjellene kan skyldes tilgjengeligheten av kjente ytre regulatorer 1, så vel som til ennå-udefinerte faktorer i celler. Derfor er det viktig å bestemme aktivitetene til mikrotubulidynamikk regulatorer og mutanter som forstyrrer dynamikken i en innfødt cellulær sammenheng.
Selv om metazo modeller har vist seg å være rådende system for undersøkelse av mikrotubuli-funksjon, og høyere ordens organisasjon, flere praktiske problemer sterkt begrense anvendbarheten av disse modellene for nøyaktig måling av mikrotubulidynamikk. Først det høye antallet mikrotubuli, alt fra titalls til tusenvis per celle, gjør det vanskelig å trygtspore individuelle mikrotubuli over tid. Mange studier møte denne utfordring med CCD-proteiner som selektivt lokaliserer til mikrotubuli-ender, slik som proteiner i slutt-binding (EB) familie. Imidlertid er disse proteinene er kjent for å lokalisere bare til endene av økende mikrotubuli i metazoans 2. Derfor er nytten av disse proteinene er begrenset til direkte måling av veksthastigheter, mens bare indirekte måling av andre aspekter av dynamikk, som frekvens for en katastrofe. For det andre, til tross for fremskritt i genomet redigering teknologi, å lage celler som stabilt uttrykker fluorescensmerket tubulin eller å innføre mutasjoner til selektivt å manipulere tubulin eller mikrotubuli-regulatorer er fortsatt en betydelig utfordring. Videre, tilstedeværelsen av mange tubulin isotyper i metazoans forvirrer studiet av hvordan mutasjoner påvirker individuelle tubulin gener.
Den spirende gjær-systemet gir flere viktige fordeler for måling av in vivo microtubule dynamikk. Gjær har en forenklet mikrotubuli-nettverk som tillater visualisering av de enkelte mikrotubuli. I gjær, mikrotubuli utgå fra organisering sentre kjent som spindelpolen legemer (SPB), som er innleiret i kjerneomslaget 3. De to SPB tjene som stillas for y-tubulin små komplekser som kjerner mikrotubuler 4, 5. SPB enheter danne kjerner av to klasser av mikrotubuli, spindel mikrotubuli og astrale mikrotubuli. Spindel mikrotubuli rager inn i nukleoplasma og er viktig for å feste til kromosomer via kinetochore mikrotubuli og for å stabilisere spindelen via overlappende interpolare mikrotubuli 6. I motsetning til dette er astrale mikrotubuli prosjekt utover inn i cytosol og forholdsvis sjelden i forhold til det tett nettverk av spindel mikrotubuli. Under mitose, pre-anafase-celler har bare 1-2 astrale mikrotubuli som stammer fra enten SPB; disse eksisterer som jegindivid mikrotubuli i stedet for som bunter 7. Rollen til astrale mikrotubuli under mitose er å bevege kjernen og spindelen i krysningspunktet mellom mor og knoppen kamrene, kjent som knoppen halsen. Denne bevegelse medfører veldefinerte trasé som genererer kraft på astrale mikrotubuler, trekke kjernen og spindelen mot og til slutt inn i knoppen halsen 8.
En annen fordel med gjær system er anvendeligheten av dets gener, som kan brukes til å undersøke mikrotubuli-regulatorer og tubulin-underenheter med ny grad av nøyaktighet. Gjær også ha en forenklet repertoar av tubulin isotyper: en enkelt β-tubulin-genet (TUB2) og to a-tubulin-genene (TUB1 og TUB3). Mutasjoner kan lett innføres i disse genene, og dermed studert i en homogen populasjon tubulin 9, 10. Det finnes en rekke anertilgjengelige konstruksjoner for merking av mikrotubuli, og disse kan være målrettet for integrering ved kromosomal loci for stabil ekspresjon (se diskusjon).
Det overordnede målet for denne metode er å avbilde enkelt mikrotubuli i levende gjærceller i fire dimensjoner (X, Y, Z og T) for høyoppløselige målinger av mikrotubulidynamikk. Fremgangsmåter for å integrere konstruksjoner for den konstitutive, lavt nivå av ekspresjon av fluorescensmerkede tubulin i gjærceller, er beskrevet. Forut for bildebehandling, og levende celler montert i glidekammere belagt med lectin concanavalin A for å stabilisere celler for langvarig avbildning. De optimale parametere for bildeinnsamling, samt en arbeidsflyt for dataanalyse, er også beskrevet.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den spirende gjær modellen gir store fordeler for å samle målinger av mikrotubulidynamikk med høy oppløsning i et in vivo miljø, inkludert muligheten til å avbilde enkelt mikrotubuli over tid, og evnen til å manipulere tubulins og mikrotubuli-regulatorer ved hjelp av verktøyene på Yeast Genetics.
De Concanavalin A-belagte kammere gir en rekke fordeler i forhold til tidligere beskrevne innretninger, inkludert smeltet agar puter. Lysbilder med kamre kan være pre-laget og la…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Kerry Bloom (University of North Carolina), Kyung Lee (NCI), Steven Markus (Colorado State University), og Elmar Schiebel (Universität Heidelberg) for å dele ulike FP-TUB1 plasmider. Vi er takknemlige for Melissa Gardner (University of Minnesota) for å trene oss i raset kammeret forberedelse metode. Dette arbeidet ble støttet av National Institutes of Health (NIH) gi R01GM112893-01A1 (til JKM) og T32GM008730 (CE).
Materials
| DOB (dropout bases) | Sunrise science | 1650 | |
| CSM-Leu | Sunrise science | 1005 | |
| Agar | Ameresco | N833 | |
| 100mm polystyrene plates | Fisher Scientific | FB0875713 | |
| ssDNA (Samon Sperm) in sterile DiH2O | Sigma-Aldrich | D7656 | resuspend at 10 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC |
| Synthetic Complete Media | Sunrise science | 1459-100 | |
| Concanavalin A | Sigma-Aldrich | L7647 | resuspend at 2 mg/mL in DiH2O. Store aliquots at -20 ºC |
| Microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-1 | |
| Microscope Coverslips | Fisher Scientific | 12-541-B | |
| Parafilm | Fisher Scientific | 13-374-12 | paraffin film |
| VALAP (Equal parts of Vaseline, lanolin and paraffin) | melt at 75 ºC before use | ||
| forceps | Fisher Scientific | 16-100-106 | |
| Poyethylene glycol (PEG) 3350 | Sigma-Aldrich | 202444 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Microscope | |||
| Ti E inverted Perfect Focus microscope | Nikon Instruments | MEA53100 | |
| 1.45 NA 100x CFI Plan Apo objective | Nikon Instruments | MRD01905 | |
| Piezo electric stage | Physik Instrumente | P-736 | |
| Spinning disk scanner | Yokogawa | CSU10 | |
| Laser combiner module | Agilent Technologies | MCL400B | |
| EMCCD camera | Andor Technology | iXon Ultra 897 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Software | |||
| NIS Elements software | Nikon Instruments | MQS31100 | |
| Microsoft Excel software | Microsoft | ||
| MATLAB software | MathWorks, Inc | ||
| ImageJ64 | NIH | Rasband, W.S., ImageJ, U. S. National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, USA, http://imagej.nih.gov/ij/, 1997-2016. | |
| Bio-Formats Importer plug-in | Open Microscopy Environment | ||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Plasmids | |||
| pUC19-LEU2::GFP-TUB1 | pSK1050 | reference: Song, S. and Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001) |
References
- Zanic, M., Widlund, P. O., Hyman, A. A., Howard, J. Synergy between XMAP215 and EB1 increases microtubule growth rates to physiological levels. Nat Cell Biol. 15 (6), 688-693 (2013).
- Mimori-Kiyosue, Y., Shiina, N., Tsukita, S. The dynamic behavior of the APC-binding protein EB1 on the distal ends of microtubules. Curr Biol. 10 (14), 865-868 (2000).
- Byers, B., Goetsch, L. Behavior of spindles and spindle plaques in the cell cycle and conjugation of Saccharomyces cerevisiae. J Bacteriol. 124 (1), 511-523 (1975).
- Marschall, L. G., Jeng, R. L., Mulholland, J., Stearns, T. Analysis of Tub4p, a yeast gamma-tubulin-like protein: implications for microtubule-organizing center function. J Cell Biol. 134 (2), 443-454 (1996).
- Spang, A., Geissler, S., Grein, K., Schiebel, E. gamma-Tubulin-like Tub4p of Saccharomyces cerevisiae is associated with the spindle pole body substructures that organize microtubules and is required for mitotic spindle formation. J Cell Biol. 134 (2), 429-441 (1996).
- Winey, M., Bloom, K. Mitotic spindle form and function. Genetics. 190 (4), 1197-1224 (2012).
- Gupta, M. L. J., et al. beta-Tubulin C354 mutations that severely decrease microtubule dynamics do not prevent nuclear migration in yeast. Mol Biol Cell. 13 (8), 2919-2932 (2002).
- Moore, J. K., Cooper, J. A. Coordinating mitosis with cell polarity: Molecular motors at the cell cortex. Semin Cell Dev Biol. 21 (3), 283-289 (2010).
- Gartz Hanson, M., et al. Novel alpha-tubulin mutation disrupts neural development and tubulin proteostasis. Dev Biol. 409 (2), 406-419 (2016).
- Fees, C. P., Aiken, J., O’Toole, E. T., Giddings, T. H. J., Moore, J. K. The negatively charged carboxy-terminal tail of beta-tubulin promotes proper chromosome segregation. Mol Biol Cell. 27 (11), 1786-1796 (2016).
- Song, S., Lee, K. S. A novel function of Saccharomyces cerevisiae CDC5 in cytokinesis. J Cell Biol. 152 (3), 451-469 (2001).
- Knop, M., et al. Epitope tagging of yeast genes using a PCR-based strategy: more tags and improved practical routines. Yeast. 15 (10B), 963-972 (1999).
- Kosco, K. A., et al. Control of microtubule dynamics by Stu2p is essential for spindle orientation and metaphase chromosome alignment in yeast. Mol Biol Cell. 12 (9), 2870-2880 (2001).
- Toso, R. J., Jordan, M. A., Farrell, K. W., Matsumoto, B., Wilson, L. Kinetic stabilization of microtubule dynamic instability in vitro by vinblastine. Biochemistry. 32 (5), 1285-1293 (1993).
- Aiken, J., Sept, D., Costanzo, M., Boone, C., Cooper, J. A., Moore, J. K. Genome-wide analysis reveals novel and discrete functions for tubulin carboxy-terminal tails. Curr Biol. 24 (12), 1295-1303 (2014).
- Straight, A. F., Marshall, W. F., Sedat, J. W., Murray, A. W. Mitosis in living budding yeast: anaphase A but no metaphase plate. Science. 277 (5325), 574-578 (1997).
- Khmelinskii, A., Lawrence, C., Roostalu, J., Schiebel, E. Cdc14-regulated midzone assembly controls anaphase B. J Cell Biol. 177 (6), 981-993 (2007).
- Markus, S. M., Omer, S., Baranowski, K., Lee, W. L. Improved Plasmids for Fluorescent Protein Tagging of Microtubules in Saccharomyces cerevisiae. Traffic. 16 (7), 773-786 (2015).
