Mesure de la lipolyse basale et stimulée par Forskolin dans des tampons de graisse adipeuse inguinale
Summary
Ce protocole décrit la méthode de détermination de la lipolyse basale et stimulée par la forskoline dans des tampons de graisse inguinal obtenus à partir d'une alimentation normale (NCD) ou d'un régime alimentaire à forte teneur en graisse (HFD), la capsaicine alimentée avec des souris de type sauvage. En tant qu'indice pour la lipolyse, la libération de glycérol a été mesurée à partir de tampons de graisse adipeuse inguinale.
Abstract
La lipolyse est un processus par lequel les lipides stockés sous forme de triglycérides dans des tissus adipeux sont hydrolysés en glycérol et en acides gras. Cet article décrit la méthode de mesure de la lipolyse basique et de la forskoline (FSK) dans les tampons gras gras inguinaux isolés à partir de souris de type sauvage alimentées soit en régime alimentaire régulier (NCD), en alimentation à forte teneur en matière grasse (HFD), soit en alimentation à forte teneur en matières grasses contenant 0,01 % De la capsaïcine (PAC: agoniste de la sous-famille Vanilloid 1 (TRPV1) du récepteur transitoire pendant 32 semaines. La méthode décrite ici pour la réalisation de la lipolyse ex vivo est adoptée à partir de Schweiger et al. 1 Nous présentons un protocole détaillé pour mesurer les niveaux de glycérol par spectrophotométrie UV-Visible (UV / VIS). La méthode décrite ici peut être utilisée pour isoler avec succès les tampons gras gras inguinaux pour des mesures de lipolyse afin d'obtenir des résultats cohérents. Le protocole décrit pour les tampons gras inguinaux peut facilement être étendu pour mesurer la lipolyse dans d'autres tissus.
Introduction
Les tissus adipeux stockent l'énergie en tant que matière grasse 2 et l'oxydation des acides gras est requise pour la thermogenèse 3 , 4 . Les acides gras ingérés par les régimes sont emballés avec des apoprotéines dans des chylomicrons et livrés à différents tissus dans le corps par circulation sanguine. Bien que la plupart des cellules dans le corps stockent une réserve d'énergie, le tissu adipeux stocke l'excès d'énergie en tant que graisse 5 , 6 . La lipolyse dans le tissu adipeux est régulée par des processus complexes et les détails moléculaires de la lipolyse restent vagues 7 .
La lipolyse est un procédé par lequel les triglycérides (TGL) stockés dans des tissus adipeux sont hydrolysés pour produire du glycérol et des acides gras (FA) par l'enzyme lipolyse liposomique adipeuse (ATGL) 8 . Les modifications de la lipolyse basale et stimulée sont une caractéristique de l'obésité. Le bLa lipolyse asal est régulée par l'activation ATGL 9 , qui convertit TGL en diacylglycérol (DAG), qui est ensuite hydrolysé en monoacyl glycerol (MAG). L'activation de la lipase sensible aux hormones (HSL) par l' adenylyl cyclase active la stimulation de la protéine kinase A (PKA) dépendante de l'adénosine et du monophosphate cyclique (AMPc) et provoque une lipolyse. La mesure de la lipolyse, basale et stimulée, est donc importante pour analyser l'activité des protéines impliquées dans ce processus. En outre, la mise au point de la régulation moléculaire de la lipolyse peut être bénéfique pour développer de nouvelles stratégies thérapeutiques contre l'obésité 10 . Étant donné que les molécules qui stimulent la lipolyse et l'oxydation des acides gras sont des candidats potentiels pour diminuer les graisses stockées dans les dépôts, il est important d'utiliser un test robuste pour la reproductibilité.
Les données publiées précédemment suggèrent que l'activation de la protéine TRPV1 exprimée dans le tissu adipeux blanc par CAP renforcé basalEt la lipolyse stimulée par FSK (adenylyl cyclase) dans des graisses inguinales 11 . Des recherches antérieures suggèrent également que l'activation à long terme de TRPV1 par CAP active la PKA 12 . Étant donné que l'activation de la PKA stimule la lipolyse 13 , 14 , mesurer à la fois la lipolyse stimulée basale et la PKA stimulée dans les graisses inguinales isolées à partir de souris NCD ou HFD (± CAP) après 32 semaines d'alimentation, les régimes respectifs valideront le rôle de TRPV1 Activation dans la lipolyse.
Cet article décrit une méthode efficace de détermination de la lipolyse basale et stimulée. Bien que d'autres méthodes qui utilisent des isotopes radioactifs de glycérol et une chromatographie en phase liquide abondante à haute performance ou une chromatographie en phase gazeuse / spectrométrie de masse pour les mesures 15 , 16 soient disponibles, cette méthode offre une plus directe, simple et rentableTechnique pour déterminer la lipolyse dans les tissus adipeux.
Protocol
Representative Results
Discussion
Le processus de dégradation de TGL dans le glycérol et les acides gras est catalysé par ATGL 9 lors de la lipolyse basale et orchestré par un ensemble de protéines, y compris l'activation de la voie dépendante de l'adénylyl cyclase / PKA pendant la lipolyse stimulée 21 , 22 , 23 . L'amélioration de la lipolyse augmente les niveaux plasmatiques d'acides gras pour le transport et l…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Prix AHA n ° 15BGIA23250030, l'Institut national des sciences médicales générales du NIH sous le numéro numéro 8P20 GM103432-12 et la Subvention de la faculté de l'Université du Wyoming à Aid to BT.
Materials
| Capsaicin | Sigma, USA | M2028 | TRPV1 agonist |
| Forskolin | Sigma, USA | F6886 | Adenylyl cyclase activator |
| DMEM | GE healthcare and life sciences, UT, USA | SH30081.01 | |
| High fat diet | Research diets, New Brunswick, USA | D12492 | Abbreviated as HFD |
| Tris | Amresco, USA | O497 | |
| Sodium chloride | Thermofisher Scientific | BP358-212 | |
| Sodium deoxycholate | Sigma, USA | D6750 | |
| Dithiothreitol | Sigma, USA | D9163 | |
| Sodium orthovanadate | Sigma, USA | S6508 | |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma, USA | P8340 | |
| Free Glycerol reagent | Sigma USA | F6428 | |
| DMSO | Sigma, USA | D8779 | |
| Triacsin C | Sigma, USA | T4540 | Acyl CoA transferase inhibitor |
| Bovine serum albumin | Sigma, USA | A7030 | |
| Chloroform | Sigma Aldrich | 31998-8 | |
| Methanol | Thermofisher Scientific, USA | A412-1 | |
| Sodium hydroxide | Amresco, USA | O583 | |
| Sodium dodecyl sulfate | Sigma, USA | L3371 | |
| Bicinchoninic acid reagent | Sigma, USA | BCA1-1KT | |
| UV-VIS Spectrophotometer | Pharmacia Biotech, NJ, USA | Ultrospec 2000 | |
| Normal chow diet | Labdiet.com | 500I | abreviated as NCD |
| C57BL/6 mice | Jackson Laboratory, CT, USA | Stock number000664 | wild type mice |
| Parafilm | Heathrow Scientific, USA | HS 234526A | |
| Glycerol standard | Sigma, USA | G7793 |
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