Visualización y análisis cuantitativo de la angiogénesis embrionaria<em> Xenopus tropicalis</em
Summary
Este protocolo demuestra un método basado en la fluorescencia para visualizar la vasculatura y para cuantificar su complejidad en Xenopus tropicalis . Los vasos sanguíneos pueden visualizarse minutos después de la inyección de un colorante fluorescente en el corazón de un embrión después de manipulaciones genéticas y / o farmacológicas para estudiar el desarrollo cardiovascular in vivo .
Abstract
Los vasos sanguíneos suministran oxígeno y nutrientes en todo el cuerpo, y la formación de la red vascular está bajo un estricto control del desarrollo. La visualización in vivo eficaz de los vasos sanguíneos y la cuantificación confiable de su complejidad son fundamentales para comprender la biología y la enfermedad de la red vascular. Aquí, proporcionamos un método detallado para visualizar los vasos sanguíneos con un colorante fluorescente comercialmente disponible, plasma humano acetilado de lipoproteína de baja densidad DiI complejo (DiI-AcLDL), y para cuantificar su complejidad en Xenopus tropicalis . Los vasos sanguíneos pueden ser etiquetados mediante una simple inyección de DiI-AcLDL en el corazón de un embrión y los vasos sanguíneos de todo el embrión se pueden visualizar en embriones vivos o fijos. Combinada con la perturbación génica por la microinyección dirigida de ácidos nucleicos y / o la aplicación en el baño de reactivos farmacológicos, las funciones de un gen o de una vía de señalización sobre el desarrollo vascular pueden ser inveEstigmatizados en una semana sin recurrir a sofisticados animales modificados genéticamente. Debido al sistema venoso bien definido de Xenopus y su angiogénesis estereotípica, el brote de vasos preexistentes, la complejidad de los vasos pueden ser cuantificados eficientemente después de experimentos de perturbación. Este protocolo relativamente simple debe servir como una herramienta de fácil acceso en diversos campos de la investigación cardiovascular.
Introduction
La vasculogénesis, la formación de nuevos vasos sanguíneos de células endoteliales recién nacidas y la angiogénesis, la formación de nuevos vasos de vasos preexistentes, son dos procesos distintos que configuran la vasculatura embrionaria 1 . Cualquier desregulación en estos procesos da como resultado varias enfermedades del corazón y anomalías estructurales de los vasos. Además, el crecimiento tumoral está asociado con un crecimiento descontrolado de vasos. Como tal, los mecanismos moleculares subyacentes a la vasculogénesis y la angiogénesis son objeto de intensa investigación [ 2] .
Xenopus y pez cebra son modelos de vertebrados atractivos para estudios de vasculogénesis y angiogénesis, por varias razones. Primero, sus embriones son pequeños; Por lo tanto, es relativamente fácil imaginar toda la vasculatura. En segundo lugar, el desarrollo embrionario es rápido; Sólo toma un par de días para que se desarrolle toda la vasculatura, durante cuyo tiempo la vascula en desarrollo Una imagen. En tercer lugar, las intervenciones genéticas y farmacológicas antes y durante la formación de los vasos son fáciles de llevar a cabo, por ejemplo mediante la microinyección de morfolino nucleótidos antisentido (MOs) en el embrión en desarrollo oa través de la aplicación de ba~no de fármacos 3 , 4 , 5 .
La ventaja única de Xenopus sobre el pez cebra es que las manipulaciones embriológicas pueden realizarse porque Xenopus sigue clivajes holoblásticos estereotípicos y el mapa embrionario del destino está bien definido 6 . Por ejemplo, es posible generar un embrión en el que sólo se manipula genéticamente un lado lateral mediante la inyección de un MO antisentido a una célula en la etapa de dos células. También es posible trasplantar el corazón primordio de un embrión a otro para determinar si el gen ejerce su función por una célula intrínseca o mecanismo -extrínsecoAsno = "xref"> 7. Aunque estas técnicas se han desarrollado principalmente en Xenopus laevis , que es alotetraploide y por lo tanto no es ideal para los estudios genéticos , pueden aplicarse directamente a Xenopus tropicalis , una especie diploide estrechamente relacionada 8 .
Una manera de visualizar la vasculatura en un embrión vivo de Xenopus es inyectar un colorante fluorescente para marcar los vasos sanguíneos. La lipoproteína de baja densidad acetilada (AcLDL) marcada con una molécula fluorescente tal como DiI es una sonda muy útil. A diferencia de la LDL no acetilada, la AcLDL no se une al receptor de LDL 9 sino que es endocitados por los macrófagos y las células endoteliales. La inyección de DiI-AcLDL en el corazón de un animal vivo resulta en el marcaje fluorescente específico de las células endoteliales, y toda la vasculatura puede ser visualizada por microscopía de fluorescencia en embriones vivos o fijos [ 4] .
Aquí prestamosDe protocolos detallados para la visualización y cuantificación de vasos sanguíneos utilizando DiI-AcLDL en Xenopus tropicalis ( Figura 1 ). Proporcionamos puntos prácticos clave, con ejemplos de experimentos exitosos y sin éxito. Además, proporcionamos un método sencillo para el análisis cuantitativo de la complejidad vascular, que podría ser útil para evaluar los efectos de factores genéticos y ambientales en la conformación de la red vascular.
Protocol
Representative Results
Discussion
El protocolo presentado aquí fue desarrollado por Ali H. Brivanlou y sus colegas para investigar eventos de desarrollo durante la formación vascular en Xenopus laevis 4 , pero, como se muestra en este manuscrito, se puede aplicar a otros animales pequeños. La inyección de colorante en el corazón es simple de realizar, y toda la red vascular puede ser visualizada bajo un microscopio de disección de fluorescencia, así como un microscopio confocal. Si el colorante se inyecta en el co…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este estudio se inspiró en el trabajo de Levine et al. , Que describió este método experimental y proporcionó una descripción completa del desarrollo vascular en Xenopus laevis. Damos las gracias a los miembros de nuestro laboratorio por su aporte. Este estudio fue apoyado por la Iniciativa de Investigación Futura de la Universidad de Yonsei de 2015 (2015-22-0095) y el Programa de Desarrollo de Tecnología Biológica y Médica de la Fundación Nacional de Investigación (NRF) financiado por el ministerio de Ciencia, TIC y Planificación del Futuro NRF – 2013M3A9D5072551)
Materials
| 35mm Petri dish | SPL | 10035 | Sylgard mold frame |
| 60mm Petri dish | SPL | 10060 | Embryo raising tray |
| Borosilicate Glass | Sutter instrument | B100-50-10 | Needle for injection |
| BSA | Sigma | A3059-10G | Coating reagent |
| CaCl2 | D.S.P.GR Reagent | 0.1X MBS component | |
| Coverslip | Superior | HSU-0111520 | For confocal imaging |
| DiI-AcLDL | Thermo Fisher Scientific | L3484 | Vessel staining solution |
| FBS | Hyclone | SH.30919.02 | For storage of testis |
| Fiber Optical Illuminator | World Precision Instruments | Z-LITE-Z | Light |
| Ficoll | Sigma | F4375 | Injection buffer |
| Flaming/Brown Micropipette Puller | Sutter instrument | P-97 | Injection needle puller |
| Forcep | Fine Science Tool | 11255-20 | For embryo hatching and needle tip cutting |
| Glass Bottom dish | SPL | 100350 | For confocal imaging |
| hCG | MNS Korea | For priming of frogs | |
| HEPES | Sigma | H3375 | Buffering agent |
| Incubator | Lab. Companion | ILP-02 | For raising embryos |
| KCl | DAEJUNG | 6566-4400 | MBS component |
| L15 medium | Gibco | 11415-114 | For storage of testis |
| L-cysteine | Sigma | 168149-100G | De-jellying reagent |
| MgSO4 | Sigma | M7506 | MBS component |
| Microtube | Axygen | MCT-175-C-S | For storage of testis |
| MS222 | Sigma | E10521 | Anesthetic powder |
| NaCl | DAEJUNG | 7647-14-5 | MBS component |
| NaOH | Sigma | S-0899 | pH adjusting reagent |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | Fixatives |
| PBS | BIOSESANG | P2007 | Buffer for imaging |
| pH paper | Sigma | P4536-100EA | For confirming pH |
| PICO-LITER INJECTOR | Waner instruments | PLI-100A | For injection |
| Pin | Pinservice | 26002-10 | For incision |
| Pinholder | Scitech Korea | 26016-12 | For incision |
| Precision Stereo Zoom Binocular Microscope | World Precision Instruments | PZMIII | For visual screening |
| Standard Manual Control Micromanipulator | Waner instruments | W4 64-0056 | For microinjection |
| SYLGARD 184 Kit | Dow Corning | For DiI injection | |
| Transfer pipette | Korea Ace Scientific Co. | YM.B78-400 | For eggs and embryo collection |
References
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