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Biochemistry

複数のマウス組織からの中間体フィラメントタンパク質の単離による老化に関連する翻訳後修飾の研究

Published: May 18, 2017
doi:
10.3791/55655
, , , ,
1Department of Cell Biology and Physiology, School of Medicine,University of North Carolina at Chapel Hill

Summary

この方法では、複数のマウス組織から中間体フィラメント（IF）タンパク質を迅速かつ効率的に単離するための生化学的手順を提示する。単離されたIFは、質量分析および他の生化学アッセイによる翻訳後修飾の変化を研究するために使用することができる。

Abstract

中間フィラメント（IF）は、アクチンフィラメントおよび微小管とともに、細胞骨格 – 各細胞の重要な構造要素 – を形成する。正常に機能するIFは細胞に機械的およびストレス回復性を与え、機能不全のIF細胞骨格は細胞の健康を損ない、多くのヒト疾患と関連している。翻訳後修飾（PTM）は、生理学的変化およびストレス条件下でIF動態を決定的に調節する。したがって、IFのPTMシグネチャーにおける変化をモニターする能力は、細胞傷害の間のストレス応答因子としてのIFシステムのより良好な機能的理解、および最終的な調整に寄与し得る。しかし、70を超える個々の遺伝子によってコードされ、組織依存的に発現される多数のIFタンパク質は、異なるPTMの相対的重要性を分類する際の大きな課題である。この目的のために、IFタンパク質上のPTMのモニタリングを可能にする方法孤立した家族のためではなく、生物全体のレベルで、この分野における研究の進展を加速させる可能性があります。ここでは、9種類のマウス組織（脳、心臓、肺、肝臓、小腸、大腸、膵臓、腎臓、および腎臓）からのIFタンパク質の総、洗浄剤可溶性および界面活性剤耐性画分の単離のための生化学的方法を提示する。脾臓）。我々はさらに、異なるマウス組織の溶解マトリックスおよび自動化されたホモジナイゼーションを用いて、IFタンパク質の迅速な単離のための最適化されたプロトコールを実証する。自動化されたプロトコルは、（複数の動物および実験群を含む疾患モデルにおけるような）高試料量の実験でIFをプロファイリングするのに有用である。得られたサンプルは、質量分析に基づくPTMプロファイリングを含む様々な下流分析に利用することができる。これらの方法を利用して、我々は、異なるマウス組織（脳および肝臓）におけるIFタンパク質がそれらの発現に関して並行して変化することを示すための新しいデータを提供する老化中のシオンレベルおよびPTMを減少させる。

Introduction

I型IVは、細胞質（ 例えば、上皮および毛ケラチン（K）、筋細胞デスミン、神経フィラメント、グリア線維性酸性タンパク質（GFAP）、および他のタイプの細胞質タンパク質である。その他）;タイプVは核ラミンであり;タイプVIはアイレンズ1の IFである。それらの分子構成に関して、IFタンパク質は、高度に保存されたコイルドコイル「ロッド」ドメインおよび球状の「頭部」および「尾部」ドメインの3つの共通ドメインを有する。 IFタンパク質四量体は、機械的保護2 、ストレス感知3,4 、転写5および成長の調節、ならびに他の重要な細胞機能に関与する動的細胞骨格および核骨格構造を形成する成熟フィラメントに最終的に組み込まれる短いフィラメント前駆体を形成するように集合する" 1,6,7 。

IFシステムの機能的重要性は、ニューロパシー、ミオパチー、皮膚脆弱性障害、代謝機能不全および早期老化症候群を含むIF遺伝子のミスセンス突然変異によって引き起こされる多くのヒト疾患の存在によって強調される8 。いくつかのIF遺伝子突然変異は、肝疾患9の単純な上皮ケラチンのような疾患の進行を引き起こさないが、そのキャリアを素因とする9 。後者は、上皮におけるIFの重要なストレス保護機能によるものである。 IFは一般に、基底条件下で最も豊富な細胞タンパク質の中に含まれていますが、様々なタイプのストレスの間にさらに強く誘導されます10 。例えば、線虫C.elegansのプロテオーム全体の変化を評価した最近の研究では、複数のIFが高度に上方制御され、凝集しやすいことが示された生物老化中に11,12。適切なIF構造の維持は、様々な形態のストレスに対する細胞の抵抗性にとって必須であるため、IF凝集はまた、老化中の機能低下に寄与し得る。しかしながら、ストレスを受けている異なる組織にわたって複数の哺乳動物IFタンパク質を試験する生物学的レベルの研究は欠けている。

IFは、細胞の要求を満たすために適応する高度に動的な構造である。ケラチンは、例えば、可溶性（非糸状）および不溶性（糸状）タンパク質プール13間の生合成に依存しないサイクリングを受ける。通常の生理学的条件下では、非イオン性界面活性剤Nonidet P-40に可溶化することができる約20％と比較して、洗浄剤を含まない緩衝液中で全K8 / K18プールの約5％を抽出することができ、 X100 14 、 </s> 15 。有糸分裂の間に、表皮ケラチンではあまり明らかではないが、ビメンチンおよび他のIII型IFタンパク質においてより明白である単純型上皮K8およびK18 14の溶解性が顕著に増加する15,16 。 IFタンパク質の溶解特性は、フィラメント再配列および溶解性のための重要な翻訳後修飾（PTM）であるリン酸化によって厳密に制御されている17,18,19,20。ほとんどのIFは、保存された部位で多数のPTMによって広範な調節を受け、機能的変化をもたらす17 。

この方法の目的は、複数のマウス組織にわたるIFタンパク質の研究のための生化学的抽出および分析方法に、IF分野の新しい研究者を紹介することである。特定我々は、高塩抽出法を用いたIFタンパク質の単離と、質量分光法およびPTM標的抗体によるPTMの変化の評価に焦点を当てている。これらの方法は以前に公表された手順21に基づいているが、異なるIFタンパク質型を抽出するための改変を含み、IFファミリーにわたる調節のための共通機構を明らかにする。例えば、特定のリジン残基でのK8アセチル化はフィラメントの組織化を制御するが、高アセチル化はK8不溶性および凝集体形成を促進する22 。最近の世界のプロテオミクスプロファイリング研究は、ほとんどの組織特異的IFタンパク質もまたアセチル化の標的であり、ほとんどのIFアセチル化部位が高度に保存されたロッドドメインに限定されることをさらに明らかにした。これにより、IFシステムのグローバルプロファイリングに適したメソッドの必要性が強調されます。我々はまた、optiでの自動ホモジナイゼーションを用いて複数の組織からIFタンパク質を単離する迅速な方法を紹介する溶解した溶解マトリックス。得られた調製物は、質量分析および他の方法による下流のPTM分析に適している。

Protocol

このプロトコルは、ノースカロライナ大学の施設内動物管理および使用委員会（IACUC）に従って承認され、実施されます。 1.準備トリトン-X緩衝液（1％トリトンX-100,5mMエチレンジアミン四酢酸（EDTA）、リン酸緩衝化生理食塩水（PBS）、pH7.4中の容量を出す）を調製する。 500mLにするには：Triton X-100と500mM EDTAをそれぞれ5mL加え、PBS490mL、pH7.4に入れる。 Triton-X緩衝液は4℃で保存し?…

Representative Results

溶解マトリックスを用いた複数のマウス組織からのIFタンパク質の高塩ベース抽出のための新しい高速方法。 上皮組織からの中間フィラメントタンパク質画分の大部分を単離する従来の方法25,26 は、ここでは9つの異なる器官および組織溶解のためのより…

Discussion

IFタンパク質が細胞および組織ストレスのマーカーおよびモジュレーターの両方であるため、IFタンパク質の生化学的特徴付けを可能にする方法は、哺乳類系における多数の病態生理学的現象を理解するのに有用であり得る。現在の方法の背後にある原則は、一般に低塩類溶液および高塩溶液を使用する細胞および組織からIFタンパク質を単離し、分離し、再構成するための1970年代および1980?…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

この研究は、NIH R01 DK110355、DK093776 [NTS]、DK102450 [NTS]、およびP30 DK034987 [UNC-チャペルヒルへの] NIH交付金によって支援された。著者らは、qPCRおよびウェスタンブロット実験の支援についてDeekshita Ramanarayananに感謝している。

Materials

Dynabeads Protein G ThermoFisher Scientific 10009 immunoprecipitation beads
PBS ThermoFisher Scientific 10010049 for buffers
Purelink RNA mini kit ThermoFisher Scientific 12183018 RNA extraction from tissue
Purelink DNAse set ThermoFisher Scientific 12185010A on column DNA digestion
Dynamag-2 ThermoFisher Scientific 12321D magnet for use with dynabeads
GelCode Blue Stain Reagent ThermoFisher Scientific 24592 mass spectrometry-compatible gel stain
Pierce ECL Western Blotting Substrate ThermoFisher Scientific 32106 for use in western blot
High Capacity cDNA reverse transcription kit ThermoFisher Scientific 4368813 for use in gene expression analysis
Proflex 3×32-well PCR System ThermoFisher Scientific 4484073 PCR system
PVDF transfer membrane  ThermoFisher Scientific 88520 for western blot
Power Up SYBR master mix ThermoFisher Scientific A25778 for qPCR analysis
RNAlater ThermoFisher Scientific AM7020 solution for tissue storage prior to RNA isolation
Novex 4-20% Tris Glycine Gel ThermoFisher Scientific XP04205BOX Precast protein gel
Anti-Keratin 8 antibody (TS1) ThermoFisher Scientific MA514428 for western blot detection of K8
Anti-Vimentin ThermoFisher Scientific MA511883 for western blot detection of vimentin
Tris Glycine Transfer Buffer (25X) ThermoFisher Scientific LC3675 for wet transfer of protein gels
2X SDS Sample Buffer ThermoFisher Scientific LC2676 for preparing protein gel samples
Tris Glycine SDS Running Buffer (10X) ThermoFisher Scientific LC26755 for running protein gels
Lysing beads – Matrix D MP Biomedicals 116913100 Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and RNA extraction
Lysing beads – Matrix SS MP Biomedicals 116921100 Lysis beads and matrix tubes for tissue disruption and protein extraction
NanoDrop Lite Spectrophotometer ThermoFisher Scientific ND-LITE measurement of protein and nucleic acid
Precellys 24 homogenizer Bertin Instruments EQ03119 Automated tissue homogenizer
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Battaglia, R. A., Kabiraj, P., Willcockson, H. H., Lian, M., Snider, N. T. Isolation of Intermediate Filament Proteins from Multiple Mouse Tissues to Study Aging-associated Post-translational Modifications. J. Vis. Exp. (123), e55655, doi:10.3791/55655 (2017).
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