Analyse du promoteur du ligand c-KIT utilisant l'immunoprécipitation de la chromatine
Summary
Les interactions ADN-protéines sont essentielles pour de multiples processus biologiques. Au cours de l'évaluation des fonctions cellulaires, l'analyse des interactions ADN-protéines est indispensable pour la compréhension de la régulation des gènes. L'immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) est un outil puissant pour analyser ces interactions in vivo.
Abstract
Plusieurs processus cellulaires, y compris la réplication et la réparation de l'ADN, la recombinaison de l'ADN et l'expression des gènes, nécessitent des interactions entre les protéines et l'ADN. Par conséquent, les interactions ADN-protéine régulent de multiples fonctions physiologiques, physiopathologiques et biologiques telles que la différenciation cellulaire, la prolifération cellulaire, le contrôle du cycle cellulaire, la stabilité chromosomique, la régulation des gènes épigénétiques et la transformation cellulaire. Dans les cellules eucaryotes, l'ADN interagit avec les protéines d'histone et de nonhistone et est condensé dans la chromatine. Plusieurs outils techniques peuvent être utilisés pour analyser les interactions ADN-protéine, telles que l'Électrophorèse (gel) Mobility Shield Assay (EMSA) et DNase I footprinting. Cependant, ces techniques analysent l'interaction protéine-ADN in vitro , pas dans le contexte cellulaire. L'immunoprécipitation de Chromatine (ChIP) est une technique qui capture des protéines sur leurs sites spécifiques de liaison à l'ADN, ce qui permet d'identifier l'interaction ADN-protéineS dans leur contexte de chromatine. Elle se fait par fixation de l'interaction ADN-protéine, suivie de l'immunoprécipitation de la protéine d'intérêt. Par la suite, le site génomique auquel la protéine était liée est caractérisé. Ici, nous décrivons et discutons ChIP et démontrons sa valeur analytique pour l'identification de la liaison induite par le facteur de croissance transformant-β (TGF-β) du facteur de transcription SMAD2 aux éléments de liaison SMAD (SBE) dans la région promoteur de la tyrosine- Facteur de cellules souches (SCF) du ligand du récepteur de protéine kinase (c-KIT).
Introduction
Dans le noyau des eucaryotes, l'ADN interagit avec les protéines d'histone et les protéines non-héroniques et est condensé dans la chromatine. Dans le contexte physiologique, pathophysiologique et biologique cellulaire, les fonctions cellulaires sont contrôlées spatialement et temporairement par l'expression des gènes coordonnés par la chromatine. Les interactions ADN-protéines jouent un rôle essentiel dans la régulation des processus cellulaires, tels que la replication, la recombinaison et la réparation de l'ADN, ainsi que l'expression des protéines. Par conséquent, l'analyse des interactions ADN-protéine est un outil indispensable dans l'évaluation de l'expression des gènes et de la fonction cellulaire.
Plusieurs techniques existent pour évaluer les interactions ADN-protéine in vitro , telles que l'essai de déplacement de mobilité de l'électrophorèse (gel) et la couche d'ADNase I 1 , 2 . Cependant, ces techniques n'analysent pas l'interaction protéine-ADN dans la chromatine et le contexte cellulaire. ChIP iUne technique qui capture des protéines liées à leurs sites spécifiques de liaison à l'ADN et facilite ainsi l'identification des interactions ADN-protéines dans le contexte de la chromatine. La technique a d'abord été développée par Gimour et Lis pour l'évaluation de la liaison de l'ARN polymérase II à des gènes spécifiques dans Escherichia coli et Drosophila melanogaster 3 , 4 . Il se fait par fixation des complexes ADN-protéine, suivi de l'extraction de la chromatine et du cisaillement de l'ADN dans des fragments de ~ 200 paires de bases (pb). Ensuite, la protéine d'intérêt liée à l'ADN est isolée par immunoprécipitation. Après l'inversion de la réticulation ADN-protéine, l'ADN est purifié et analysé. Plusieurs méthodes peuvent être utilisées pour l'analyse des sites de liaison aux protéines et dépendent de la séquence d'acide nucléique du site de liaison de protéines dans le gène cible 5 . Dans les cas où la séquence d'ADN est connue, Pol standardOn peut appliquer des réactions en chaîne de l'ymerase (PCR), en utilisant des paires d'amorces spécifiques flanquant le site de liaison connu. La PCR quantitative en temps réel (qRT-PCR) peut également être utilisée 6 . Dans les cas où la séquence est inconnue, le ChIP peut être combiné avec des microarrays d'ADN (ChIP-on-chip), un séquençage d'ADN (ChIP-seq) ou des techniques de clonage 7 , 8 , 9 .
La voie TGF-β présente de puissantes fonctions de suppression de tumeur et constitue une voie clé dans la différenciation cellulaire. Il est activé par la liaison du ligand TGF-β1 à son complexe récepteur apparenté, ce qui entraîne la phosphatation serine des facteurs de transcription SMAD2 / 3. Après leur association avec le médiateur commun, SMAD4, le complexe SMAD se transforme en noyau et se lie au SBE dans la région promotrice des gènes cibles, où il régule les gènes contrôlant le cycle cellulaire, l'apoptose et la différentiation cellulairesur. La réponse transcriptionnelle à la stimulation TGF-β est le type de cellule et le contexte spécifique 10 . Récemment, nous avons décrit une boucle de réaction positive entre le TGF-β et la voie c-KIT 11 . Dans ce modèle, le SMAD2 activé par TGF-β1 se lie au promoteur du ligand c-KIT et induit son expression et sa sécrétion. Par la suite, le ligand c-KIT active le récepteur c-KIT de manière auto-para-crinique. L'activation du récepteur c-KIT entraîne la phosphorylation STAT3 Tyr 705 via JAK1 / 2. Après l'activation de STAT3 et la translocation nucléaire, STAT3 se lie au gène du ligand TGF-β1 et régule son expression.
Ici, nous démontrons le rôle essentiel de l'analyse ChIP pour l'identification de la liaison SMAD2 au promoteur du ligand du récepteur c-KIT et pour l'identification du Transducteur de signal (et) Activateur (de) Transcription 3 (liaison STAT3 au TGF-β1- gène).
Protocol
Representative Results
Discussion
Dans ce rapport, nous démontrons la liaison induite par le TGF-β1 de SMAD2 à un SBE dans le promoteur du ligand c-KIT et la liaison induite par TGF-β1 de STAT3 à sa séquence de reconnaissance dans le gène du ligand TGF-β1. Nous démontrons la liaison induite par les cytokines des deux facteurs de transcription en utilisant l'immunoprécipitation de la chromatine.
L'immunoprécipitation de la chromatine est un outil puissant pour démontrer la liaison directe d'une protéi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par l'Université du Texas MD Anderson Cancer Center, Houston, TX (fonds de démarrage, BB).
Materials
| HepG2 cells | ATCC | HB-8065 | |
| Hep3B cells | ATCC | HB-8064 | |
| TGF-β1 | R&D Systems | 101-B1 | Used at a concentration of 10 ng/ml |
| Anti-SMAD2 antibody | Cell Signalling Technology | 5339 | Amount used per IP: 3 µg |
| Anti-STAT3 antibody | Cell Signalling Technology | 4904 | Amount used per IP: 3 µg |
| ChIP-IT Protein G Magnetic Beads | Active Motif | 53033 | |
| Protease Inhibitor Cocktail | Active Motif | 37490 | |
| Micrococcal Nuclease | Cell Signalling Technology | 10011 | |
| PCR forward primer: PAI-1 | Sequence: 5’-GGAAGAGGATAAAGGACAAGCTG-3’ | ||
| PCR reverse primer: PAI-1 | Sequence: 5’-TGCAGCCAGCCACGTGATTGTC-3’ | ||
| PCR forward primer: SCF | Sequence: 5’-CACTGATGTTAATGTTCAGC-3’ | ||
| PCR reverse primer: SCF | Sequence: 5’-GCTCTAATTTAAACCTGGAGC-3’ | ||
| PCR forward primer: TGF-β1 (STB-1) | Sequence: 5’-GAGAGAGACGTGAGTGGCATGTT-3’ | ||
| PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-1) | Sequence: 5’-TAGCTTTCTCTGCCTTGGTCTCCCC-3’ | ||
| PCR forward primer: TGF-β1 (STB-2) | Sequence: 5’-GTACTGGGGGAGGAGCGGCATC-3’ | ||
| PCR reverse primer: TGF-β1 (STB-2) | Sequence: 5’-TGCCACTGTCTGGAGAGAGGTGTGTC-3’ |
References
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