Evaluación de la complejidad dendrítica del hipocampo en ratones envejecidos utilizando el método de Golgi-Cox
Summary
Aquí presentamos un protocolo de Golgi-Cox en detalle extenso. Este método fiable de tinción de tejidos permite una evaluación de alta calidad de la citoarquitectura en el hipocampo, ya lo largo de todo el cerebro, con un mínimo de resolución de problemas.
Abstract
Las espinas dendríticas son las protuberancias de los ejes neuronales dendríticos que contienen sinapsis excitatorias. Las variaciones morfológicas y ramificadas de las dendritas neuronales dentro del hipocampo están implicadas en la cognición y en la formación de la memoria. Existen varios enfoques para la tinción de Golgi, todos los cuales han sido útiles para determinar las características morfológicas de los mandrales dendríticos y producir un fondo claro. El presente método de Golgi-Cox (una ligera variación del protocolo que se proporciona con un kit de tinción de Golgi comercial), fue diseñado para evaluar cómo una dosis relativamente baja del fármaco quimioterapéutico 5-flurouracilo (5-Fu) afectaría a la morfología dendrítica , El número de espinas y la complejidad de la arborización dentro del hipocampo. El 5-Fu moduló significativamente la complejidad dendrítica y disminuyó la densidad de la columna a lo largo del hipocampo de una manera específica de la región. Los datos presentados muestran que el método de tinción de Golgi efFectivamente teñido las neuronas maduras en el CA1, el CA3, y el giro dentado (DG) del hipocampo. Este protocolo informa los detalles de cada paso para que otros investigadores puedan manchar el tejido con fiabilidad a través del cerebro con resultados de alta calidad y solución de problemas mínima.
Introduction
Las dendritas son la mayor parte de las neuronas que reciben y procesan la entrada presináptica 1 . Sus procesos dendríticos tienen una geometría compleja, donde las ramas proximales tienen un diámetro mayor que las ramas distales. A medida que las dendritas se desarrollan, forman varias conexiones con otras neuronas en un proceso denominado arborización dendrítica. La extensión y el patrón de esta ramificación determina la cantidad de entradas sinápticas que una dendrita puede procesar adecuadamente 2 .
La arborización dendrítica es un proceso necesario para la plasticidad dependiente de la actividad y el desarrollo adecuado de los circuitos neuronales. La extensión, la retracción, la ramificación y la sinaptogénesis son procesos intrincados que incluyen programas genéticos intrínsecos e influencias de factores extrínsecos. Las variaciones morfológicas y ramificadas de las dendritas neuronales dentro del hipocampo están implicadas en la cognición y en la formación de la memoriaF "> 3 , 4. Las alteraciones en la complejidad dendrítica están asociadas con cambios fisiopatológicos y de comportamiento 5. Las anomalías están relacionadas con varios estados patológicos, incluyendo el Síndrome del Frágil X y el Síndrome de Down 6 .
Las espinas dendríticas son los compartimentos subcelulares especializados de los arboles dendríticos que reciben entrada excitatoria dentro del sistema nervioso central. Hay tres clases morfológicas de espinas dendríticas, con el nombre de cada clase en función de su tamaño y forma: 1) espinas de hongos, que tienen densidades postsinápticas complejas con más receptores de glutamato que otras espinas 7 ; 2) espinas dorsales, que carecen de un tallo; Y 3) espinas delgadas, que consisten en un tallo estrecho prolongado y una cabeza globular 8 . El volumen de la columna dendrítica se utiliza en parte para definirlos, con espinas delgadas, generalmente más pequeñas (0,01 μm 3 </sup>) En comparación con las espinas de hongos (0,8 μ m 3 ) 9 , 10 . Las espinas se estabilizan con la maduración. Por ejemplo, las espinas delgadas se retraen después de unos días o se convierten en espinas de hongos. Alternativamente, las espinas de hongo son relativamente estables y pueden sobrevivir durante un período prolongado. Se cree que la fuerza de las conexiones neuronales se basa en el número de espinas y / o en su volumen 11 , 12 , 13 .
El método clásico de tinción de Golgi y sus variaciones más modernas han sido útiles para examinar la morfología y densidad de la columna dendrítica. Un aspecto único de la tinción de Golgi es que mancha aleatoriamente alrededor del 5% de las neuronas totales, lo que permite el rastreo de las neuronas individuales [ 14 , 15] . Aunque el mecanismo exacto en el que el método de GolgiOd manchas neuronas individuales es todavía desconocido, el principio del método se basa en la cristalización de cromato de plata (Ag 2 CrO 4 ) [ 16 , 17] . Hay tres tipos principales del método de Golgi: el Golgi rápido, el Golgi-Cox, y el Golgi-Kopsch 18 , 19 . Los tres métodos comienzan con una fase de incubación inicial en sales de cromo durante varios días a meses, pero hay ciertas diferencias clave entre ellos. El Golgi rápido utiliza tetróxido de osmio en el primer paso, mientras que Golgi-Kopsch incluye paraformaldehído. La tinción tanto en el Golgi rápido como en Golgi-Kopsch es seguida por una incubación en una solución de nitrato de plata al 1-2% durante aproximadamente 7 días. El método de Golgi-Cox utiliza cloruro de mercurio y dicromato de potasio en lugar de nitrato de plata y tiene un tiempo de impregnación de 2-4 semanas. Los tejidos se seccionan y se colocan rápidamente en un amoníaco diluido, Seguido por un fijador fotográfico para eliminar las sales. De los tres tipos, se piensa que el método de Golgi-Cox es el mejor en la tinción de los mandrales dendríticos sin mucha interferencia de fondo, en parte, porque los artefactos de cristal no se producen en la superficie del tejido (a diferencia del método de Golgi rápido) 17 , 20 , 21 .
El presente método es una ligera variación del protocolo proporcionado con un kit comercial de tinción con Golgi, y fue diseñado para evaluar cómo una dosis relativamente baja del 5-Fu afectaría las características morfológicas dendríticas y la densidad de la columna vertebral. Cualquier información adquirida podría proporcionar más información sobre cómo el tratamiento quimioterapéutico afecta a los circuitos neuronales.
Protocol
Representative Results
Discussion
En comparación con técnicas más modernas, el método de Golgi-Cox tiene varias ventajas que lo convierten en el método preferido para examinar la morfología de la columna vertebral: 1) La tinción se puede utilizar para esencialmente cualquier tejido, 2) Una configuración básica de microscopio de luz es todo lo que se necesita para Adquirir imágenes de Golgi, 3) la imagen de Golgi-Cox es más rápida que la imagen confocal y 4) las secciones teñidas de Golgi son viables durante varios meses a años más que las…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por una subvención piloto bajo NIH P20 GM109005 (ARA) y por el Centro para la Neurociencia Translacional IDeA programa premio P30 GM110702.
Materials
| superGolgi Kit | Bioenno Lifesciences | 30100 | Contains hazardous materials. |
| PBS 10X powder concentrate | Fisher | BP665-1 | |
| Triton X-100 | Sigma | 9002-93-1 | |
| Permount | Fisher | SP 15-100 | |
| Slide cover | Fisher | 12-546-14 | |
| 7mL Transfer pipette | Globe Scientific | 135030 | |
| 10 mL Falcon tubes | BD Biosciences | 352099 | |
| Foil | Fisher | 01-213-105 | |
| 12-well plate | BD Biosciences | 353043 | |
| 200 proof Ethanol | Pharmco-AAPER | 111000200 | |
| Xylene | Acros Organics | 1330-20-7 | Hazardous. |
| Permabond 200 | Permabond LLC | GF2492 | |
| 25 mL serological pipette | Sigma | SIAL1489 | |
| Parafilm | Midsci | HS234526C | |
| Vibratome | World Precision Instruments | NVSLM1 | |
| C57Bl/6 Male Mice | The Jackson Laboratory | 000664 | |
| Axio Imager 2 | ZEISS | Multiple components, see website for details. | |
| AxioCam MRc Camera | ZEISS | 426508-9902-000 | |
| Staining Dish , Green | Tissue-Tek | 62541-12 | |
| Staining Dish Set | Electron Microscopy Sciences | 70312-20 | |
| Motorized Pipet Filler | Fisher | 03-692-168 | |
| Neurolucida | mbf Bioscience | ||
| Neurolucida Explorer | mbf Bioscience | ||
| Prism | GraphPad |
References
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