הליך זה מתאר כיצד במהירות ליזום, להרחיב ולחבר neurites מאורגן בתאי microfluidic באמצעות poly-D- ליזין מצופה חרוזים קבוע micropipettes כי מדריך התארכות neurite.
הרשמה ל-JoVE נדרשת לצפייה בתוכן זה. התחברו או התחילו בגרסת ניסיון בחינם.
מאמר שיטה
Reiring מעגלים נוירונים: שיטה חדשה להארכה Neurite מהיר חיבור פונקציונלי העצבית
במאמר זה
סיכום
תקציר
פגיעה במוח ובחוט השדרה עלולה להוביל למוות ולמוות קבועים, משום שעדיין לא ניתן ליצור מחדש נוירונים על פני מרחקים ארוכים ולחבר אותם במדויק עם מטרה מתאימה. הנה הליך המתואר במהירות ליזום, להאריך, בדיוק לחבר מעגלים נוירונים פונקציונליים חדשים על פני מרחקים ארוכים. שיעורי ההארכה שהושגו להגיע מעל 1.2 מ"מ / שעה, 30-60 פעמים מהר יותר מאשר את שיעורי vivo של האקסונים הצומחים במהירות ממערכת העצבים ההיקפית (0.02-0.44 מ"מ / שעה) 28 ו 10 פעמים מהר יותר מאשר דיווח בעבר סוג נוירונים בשלב מוקדם יותר של התפתחות 4 . ראשית, אוכלוסיות מבודדות של נוירונים בהיפוקמפוס חולדה גדלים במשך 2-3 שבועות במכשירים microfluidic למיקום המדויק של התאים, המאפשר micromanipulation קל וניבוי ניסיוני. הבא, חרוזים מצופה poly-D- ליזין (PDL) ממוקמים על neurites כדי ליצור דבק contמעשים ו micromanipulation פיפטה משמש להזיז את החרוז שנוצר neadite חרוז. כמו חרוז הוא זז, זה מושך neurite חדש שיכול להיות המורחבת על מאות מיקרומטר מחובר תפקודית לתא היעד בתוך פחות מ 1 שעות. תהליך זה מאפשר שחזור נסיוני וקלות של מניפולציה תוך עקיפת אסטרטגיות כימיות איטיות יותר כדי לעודד צמיחה neurite. מדידות ראשוניות המוצגות כאן מדגימות קצב גידול עצבי הרבה מעבר לפיזיולוגיה. שילוב החידושים הללו מאפשר הקמה מדויקת של רשתות עצביות בתרבות עם מידה חסרת תקדים של שליטה. זוהי שיטה חדשנית שפותחת את הדלת שפע של מידע ותובנות שידור אות תקשורת בתוך הרשת העצבית כמו גם להיות מגרש משחקים שבו לחקור את גבולות הצמיחה העצבית. יישומים פוטנציאליים וניסויים נפוצים עם השלכות ישירות על טיפולים שמטרתם להתחבר neuronaמעגלים לאחר טראומה או במחלות נוירודגנרטיביות.
מבוא
פציעות במערכת העצבים המרכזית הבוגרת (CNS) עלולות להוביל לנכות קבועה בשל מנגנונים מרובים המגבילים את הצמיחה מחדש של הצירים. בעקבות פציעה, רבים אקסונים CNS לא יוצרים קונוס צמיחה חדשה להיכשל תגובה משובי יעיל 2 . יתר על כן, נזק ורקמת צלקת סביב נגעים CNS לעכב באופן משמעותי צמיחה axonal 1 , 2 , 3 . טיפולים הנוכחי כדי לקדם התחדשות CNS לאחר הפציעה התמקדו בשיפור פוטנציאל הצמיחה המהותי של הנוירון הפצוע ועל מסיכה את מעכבי הארכת סיבי המשויך פסולת מיאלין צלקת גלייה 1 , 3
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
פרוטוקול
כל הנהלים המפורטים להלן אושרו על ידי ועדת טיפול בבעלי חיים של אוניברסיטת מקגיל ועמדו בקווים המנחים של המועצה הקנדית לטיפול בבעלי חיים.
1. סטנדרטיזציה של תרבויות עצביים באמצעות התקנים Microfluidic: הרכבה המכשיר
- בחר מכשיר מתאים microfluidic לניסוי הרצוי. כדי לחבר נוירונים בתוך אותה האוכלוסייה, להשתמש התקנים נוירו ( איור 1 ) ו לחבר נוירונים באוכלוסיות שונות להשתמש Co- תרבות התקנים ( איור 6 ).
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
תוצאות
עובריים עכברוש נוירונים בהיפוקמפוס הם מתורבת במכשירים microfluidic כדי לאפשר מיקום מדויק של תאים, PDL חרוזים micromanipulators. הצעד הראשון הוא כראוי להרכיב את המכשיר microfluidic על coverslip זכוכית או צלחת. זה חיוני כי המכשיר microfluidic להיות מחובר היטב המצע, כדי למנוע תאים היוצאים מן החדרים נעים מתחת לחלקים של המכשיר כי צריך להיות אטום ( איור 1 א ). כדי לשמור על תרבויות בריאות במשך מספר שבועות, חשוב למנוע אידוי בי.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
דיון
באמצעות micromanipulation רגיל ומכשירים microfluidic חדשניים, טכניקה חדשה פותחה כדי ליזום במהירות, להאריך ולדויק לחבר מעגלים נוירונים פונקציונליים חדשים על פני מרחקים גדולים. פיפטה micromanipulation הוא כלי נפוץ ביותר במעבדות המוח 4 , 13 . האתגר האמיתי להשגת תוצאות לשחזור ואמינה היה סטנדרטיזציה של תרבויות נוירונים בריאים, הממוקמים במדויק במשך תקופת הניסוי (אשר יכול להיות על פי סדר של שבועות) באמצעות פיתוח של התקנים microfl.......
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
גילויים
המחבר מרגרט H Magdesian הוא מנכ"ל אננדה התקנים המייצרת מכשירים המשמשים במאמר זה.
תודות
אנחנו רוצים להודות יואיצ'י Miyahara על דיונים מועילים רבים תובנות. MA ו PG להכיר מימון NSERC.
....הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
חומרים
| שם | חברה | מספר קטלוג | הערות |
|---|---|---|---|
| התקני קו-תרבית | Ananda Devices | זמינים מסחרית ב-http://www.anandadevices.com | |
| Neuro | Devices Ananda Devices | זמינים מסחרית ב-http://www.anandadevices.com | |
| מס' 1 כיסוי זכוכית 25 מ"מ עגול | Warner Instruments | 64-0705 | |
| 35 מ"מ תחתית זכוכית צלחות #0, לא מצופה, | תאגיד MatTex | P35G-0-20-C | |
| צלחת תרבית תאים 35 מ"מ, לא פירוגנית, | צלחת פטרי | 430165 | |
| 95 מ"מ x 15 מ"מ, מכסה ניתן להחלקה, פוליסטירן סטרילי | פישרברנד | FB0875714G | |
| צינורות צנטריפוגה 50 מ"ל עם סימונים מודפסים וכובעים שטוחים | VWR | 89039-656 | |
| צינור חרוטי פוליפרופילן 15 מ"ל, סגנון 17 x 120 מ"מ, לא פירוגני, בז סטרילי | |||
| Neurobasal Medium | Life Technologies | 21103-049 | תמיסה חוץ-תאית |
| (50X), | תוסף B-27 ללא סרום (50X), ללא סרום | 17504044 | תמיסה חוץ-תאית |
| פניצילין, סטרפטומיוצין, גלוטמין | תרמו פישר סיינטיפיק | 11995-065 | פתרון חוץ-תאי |
| 200 μ L Pipettors | VWR | 89079-458 | |
| 2 - 20 μ L פיפטורים | טיפים עמידים לתרסיס | 2149P | |
| BD Falcon 3 מ"ל פיפטות העברה [לא סטריליות] | BD Falcon | 357524 | |
| גלוקוז | Gibco | 15023-021 | תמיסה חוץ-תאית |
| HEPES | Sigma | 7365-45-9 | תמיסה/חרוזים חוץ-תאיים |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 7647-14-5 | תמיסה |
| חוץ-תאיתKCl | Sigma-Aldrich | 7447-40-7 | תמיסה חוץ-תאית |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 10043-52-4 | תמיסה חוץ-תאית |
| MgCl2 | Sigma-Aldrich | 7786-30-3 | פתרון חוץ-תאי |
| #5 פינצטה Dumont Dumostar 11 ס"מ | מכשירי דיוק עולמיים | 500233 | |
| כלי דיסקציה | בראון, Aesculap | ||
| Poly-D-lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P6407 | |
| מיקרו חלקיקים המבוססים על פוליסטירן, 10 μ m | Sigma-Aldrich | 72986 | |
| צינורות בורוסיליקט | King Precision Glass, Inc. | 14696-2 | |
| אופקי חולץ פיפטה | Sutter Instruments | מיקרומניפולטורים P-97 | |
| מכשירי SD | מסדרת PCS-5000 | MC7600R | |
| מזרק 1 מ"ל | BD Luer-Lok | 309628 | |
| מיקרוסקופ הפוך | אולימפוס | IX71 | |
| אובייקטיבי | אולימפוס | UIS2, LUCPLFLN 40X | |
| CCD | מצלמה פוטומטרית | מפל II: 512 | |
| לייבוביץ (1x) L-15 Medium | Life Technologies | 11415-064 | Rat Dissection |
| Typsin-EDTA (0.05%), פנול אדום | Life Technologies | 25300054 | דיסקציה |
| של חולדותDMEM (1x) מדיום נשר מעובד של Dulbecco [+4.5 גרם/ליטר D-גלוקוז, + L-גלוטמין, + 110 מ"ג/ליטר נתרן פירובט] | Life Technologies | 11995-065 | דיסקציה של חולדות |
| HBSS (1x) תמיסת המלח המאוזנת של האנק [- סידן כלורי, - מגנזיום כלוריד, - מגנזיום גופרתי] | Life Technologies | 14170-112 | דיסקציה של חולדות |
מקורות
- Chew, D. J., Fawcett, J. W., Andrews, M. R. The challenges of long-distance axon regeneration in the injured CNS. Prog. Brain. Res. 201, 253-294 (2012).
- Bradke, F., Fawcett, J. W., Spira, M. E. Assembly of a new growth cone after axotomy: the precursor to ax....
הגישה מוגבלת. התחברו או התחילו תקופת ניסיון כדי לצפות בתוכן זה.
הדפסות חוזרות והרשאות
