Kvantificering af abdominal pigmentering i<em> Drosophila melanogaster</em

Summary

Dette arbejde præsenterer en metode til hurtigt og præcist at kvantificere abdominal pigmentering af Drosophila melanogaster ved hjælp af digital billedanalyse . Denne metode strømlinierer procedurerne mellem fænotypeindsamling og dataanalyse og omfatter prøvemontering, billedoptagelse, pixelværdisekstraktion og egenskabsmåling.

Abstract

Pigmentering er et morfologisk simpelt men meget variabelt træk, som ofte har adaptiv betydning. Det har tjent udbredt som en model til forståelse for udviklingen og udviklingen af ​​morfologiske fænotyper. Abdominal pigmentering i Drosophila melanogaster har været særlig nyttig, så forskere kan identificere de loci, der ligger til grund for inter- og intraspecifikke variationer i morfologi. Hidtil har D. melanogaster abdominale pigmentering i vid udstrækning blevet analyseret kvalitativt gennem scoring snarere end kvantitativt, hvilket begrænser formerne for statistisk analyse, som kan anvendes på pigmenteringsdata. Dette værk beskriver en ny metode, der muliggør kvantificering af forskellige aspekter af abdominal pigmenteringsmønster af voksen D. melanogaster . Protokollen omfatter prøvemontering, billedoptagelse, dataudvinding og analyse. Al den software, der bruges til makroer til billedoptagelse og analysefunktionerSkrevet til open source image analyse. Fordelen ved denne fremgangsmåde er evnen til præcist at måle pigmenteringskarakteristika ved anvendelse af en metode, der er stærkt reproducerbar på tværs af forskellige billeddannelsessystemer. Selv om teknikken er blevet brugt til at måle variation i tergalpigmenteringsmønstre af voksen D. melanogaster , er metoden fleksibel og bredt anvendelig på pigmenteringsmønstre i utallige forskellige organismer.

Introduction

Pigmentering viser enorm fænotypisk variation mellem arter, populationer og individer, og endog inden for enkeltpersoner under ontogeni ^{1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6} . Selv om der er utallige studier af pigmentering i en bred vifte af dyr, er pigmentering måske bedst studeret i Drosophila melanogaster , hvor den fulde kraft af molekylær genetik er blevet brugt til at belyse de udviklingsmæssige og fysiologiske mekanismer, som regulerer pigmentering og hvordan disse mekanismer udvikler sig ^{1 , 6} . Meget er kendt om generne der regulerer den biokemiske syntese af pigmenter i D. melanogaster ^{7 , 8} og generne der styrer den tidsmæssige og rumlige diFordeling af denne biosyntese ^{9 , 10 , 11 , 12 , 13} . Endvidere har genetisk kortlægning identificeret de genetiske lokaliteter, der ligger til grund for intra- og interspecifikke forskelle i pigmentering i D. melanogaster ^{14 , 15 , 16 , 17} . Sammenhængen mellem pigmentering og pleiotropiske træk, såsom adfærd ^{18 , 19} og immunitet ^{19 , 20} , er også blevet undersøgt, ligesom den adaptive betydning af pigmenteringsmønstre ^{15 , 21 , 22} . Som sådan er pigmentering i D. melanogaster fremkommet som en kraftfuld, men simpel mOdel for udvikling og udvikling af komplekse fænotyper.

Pigmentering i voksen D. melanogaster er karakteriseret ved forskellige melaniseringsmønstre over hele kroppen, især på vingerne og dorsale thorax og mave. Det er pigmenteringen af ​​hver kutikulær plade (tergit) på dorsalunderlivet, der dog har fået mest forskningsopmærksomhed. Der er betydelig variation i denne pigmentering ( figur 1A- F ) på grund af både genetiske ^{17 , 23} og miljø ^{24 , 25} faktorer. Kirtiklen af ​​en abdominal tergit består af forreste og bageste udviklingsrum ( figur 1G ), som hver især kan opdeles yderligere, afhængig af pigmentering og udsmykning ²⁶ . Det forreste rum indeholder seks krydderierTyper (a1-a6), og det bageste rum indeholder tre (p1-p3) ( figur 1G ). Af disse foldes p1-, p2- og a1-kutiklen typisk under tergitten i ustrakte abdomener, så de er skjulte. Den pålideligt synlige kutikula er kendetegnet ved et band med tung pigmentering, heri omtalt som et "pigmentbånd", der består af kutikeltyper a4 (håret med moderat børstehår) og a5 (håret med store børster) med bandets bageste kant Mere intenst pigmenteret end den forreste kant ( figur 1G ). Foran for dette band er en region med let pigmenteret håret kutikula, som har børster bagtil (a3), men ikke anteriorly (a2). Variation i pigmentering mellem fluer observeres i både intensiteten af ​​pigmentering og i bredden af ​​pigmentbåndet. Generelt er variation størst i de mest bageste segmenter (mavesegmenterne 5, 6 og 7) og er lavere i de mere fremre segmenter (abdominal seGment 3 og 4) ²⁴ . Derudover er der en seksuel dimorfisme i D. melanogaster pigmentering, hvor mænd generelt har fuldt pigmenteret femte og sjette buk tergitter ( figur 4C ).

I de fleste studier af abdominal pigmentering i D. melanogaster er pigmentering blevet behandlet som et kategorisk eller ordinært træk, idet mønsteret måles kvalitativt ^{27 , 28 , 29} eller semikvantitativt på en skala ^{14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 31 , 32 , 33 , 34 , 3536 , 37} . Disse metoder har uundgåeligt en mangel på præcision, og fordi de er afhængige af den subjektive vurdering af pigmentering, er det svært at sammenligne dataene i tværs af undersøgelserne. Flere forfattere har kvantificeret de rumlige dimensioner af pigmentering ^{38 , 39} , intensiteten af ​​pigmentering af en bestemt kutikeltype ^{23 , 25 , 39 , 40} eller den gennemsnitlige intensitet af pigmentering over buk-tergitten som helhed ^{41 , 42 , 43} . Ikke desto mindre måler disse kvantificeringsmetoder ikke både intensiteten og den rumlige fordeling af abdominal pigmentering samtidigt og derfor ikke fanger nuancerne af, hvordan pigmentering varierer over abdOminal tergite. Desuden kræver adskillige af disse kvantificeringsmetoder ^{38 , 41 , 42 , 43} dissektionen og montering af abdominal cuticle. Dette er både tidskrævende og ødelægger prøven, hvilket gør den utilgængelig til yderligere morfologiske analyser. Da forståelsen af ​​udvikling og udvikling af abdominal pigmentering fordybes, vil mere sofistikerede værktøjer til hurtigt og præcist måle både rumlig fordeling og intensitet af pigmentering kræves.

Det overordnede mål med denne metode er at udnytte digital billedanalyse for at opnå en replikerbar og mere præcis måling af abdominal pigmentering i D. melanogaster . Metoden omfatter tre faser. For det første er den voksne flyve ikke destruktivt monteret, og et digitalt billede af dorsalunderlivet er taget. For det andet bruger brugeren en ImageJ-makroDefinerer en anterior-posterior stribe af pixels, der strækker sig fra forenden af ​​a2-cuticleen til den bageste af a5-kutikulaen (grøn boks, figur 1G ) på både det tredje og det fjerde abdominalsegment. Den gennemsnitlige pixelværdi på tværs af bredden af ​​denne strimmel ekstraheres derefter langs sin længdeakse, hvilket frembringer en profil, der fanger den rumlige fordeling og intensiteten af ​​pigmentering, når den ændrer sig fra den forreste til den bageste del af tergitten. For det tredje bruges et R-script til at beskrive pigmenteringsprofilen matematisk ved hjælp af en kubisk spline. R-scriptet anvender derefter spline og dets første og andet derivat til at ekstrahere bredden af ​​a2-a5-cuticleen, pigmentbåndets bredde og de maksimale og minimale pigmenteringsniveauer. Metoden kvantificerer derfor både de rumlige egenskaber og dybden af ​​abdominal pigmentering.

Denne metode kvantificerer pigmenteringen af ​​den tredje og fjerde abdominal tergit,Som har været i fokus for mange tidligere studier ^{1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42} , enten udelukkende eller i kombination med mere posterior tergitter. Selvom den er mindre variabel end den femte og den sekste abdominale tergitter, er den tredje og fjerde tergit ikke fuldstændigt pigmenteret hos mænd, så denne protokol kan anvendes til både mænd og kvinder. Ikke desto mindre, som vist her, kan protokollen anvendes til måling af pigmentering i femte og sjette buk tergitter hos kvinder. Endvidere bør mindre modifikationer af de skrifter, der anvendes til ekstraktion af pigmenteringsprofilens karakteristika, tillade, at metoden anvendes til at kvantificere variationen i pigmentering i en lang række andreorganismer.

Protocol

1. Prøvemontering BEMÆRK: Opbevar døde fluer i 70% ethanol i vand før billeddannelse. Hæld 10 ml 1,25% agar opløst i kogende vand i en 60 mm x 15 mm petriskål, og lad den indstille. Under et dissekeringsmikroskop skal du bruge et par fint punktpinde til at lave en ~ 20 mm ong, 2 mm bred, 1 mm dyb rille i gelens overflade. Ved hjælp af fine tang, indlejrer du den ventrale side af en voksenflyv i rillen med den dorsale side af fluen, der rager over gelen. BE…

Representative Results

Protokollen blev brugt til at undersøge virkningen af ​​opdrætstemperatur på abdominal pigmentering. Tidligere undersøgelser har vist, at en stigning i udviklingstemperaturen resulterer i et fald i spredningen af ​​abdominal pigmentering hos flere arter af Drosophila , herunder D. melanogaster 30 , 32 . Specifikt falder pigmentens omfang (bredden af ​​pigmentbåndet) i mave-tergitter 3 og 4 fra 1…

Discussion

Denne metode muliggør den præcise, hurtige og gentagelige opsamling af pigmenteringsdata i en kvantitativ form, som er egnet til flere downstream-analyser. Metoden er blevet brugt til at indhente data om effekten af ​​temperatur på abdominal pigmentering i en isogen fluevogn. Metoden kan dog anvendes i fremad genetik undersøgelser for at identificere gener, der ligger til grund for pigmenteringsforskelle mellem individer, populationer eller arter eller omvendte genetiske undersøgelser for at undersøge virkning…

Materials

Dumont #5 Biology Forceps	FST	11252-30
Agar	Sigma-Aldrich	5040
Dissecting Scope	Leica	MZ16FA
Base	Leica	MDG41
Camera	Leica	DFC280
Gooseneck Cold Light Source	Schott	ACE 1
Image Acquisition Control Software	Micro-Manager v1.3.20		https://micro-manager.org/
Image Analysis Software	ImageJ		https://imagej.nih.gov/ij/
Data Analysis Software	R 3.3.2		https://www.r-project.org/
LED	Thor Labs	LEDWE-15
Multimeter	Fluke	Fluke 75 Series II
60 x 15 mm Petri dish	Celltreat Scientific Products	229663
Stage micrometer	Klarman Rulings, Inc.	KR-867