JoVE Journal > Genetics
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
Automatic Translation
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
Genetics

Kwantificering van buikpigmentatie in<em> Drosophila melanogaster</em

Published: June 01, 2017
doi:
10.3791/55732
,
1Department of Biology,Lake Forest College

Summary

Dit werk biedt een methode om de abdominale pigmentatie van Drosophila melanogaster snel en nauwkeurig te kwantificeren met behulp van digitale beeldanalyse . Deze methode stroomlijnt de procedures tussen fenotype-acquisitie en data-analyse en omvat voorbeeldmontage, beeldverzameling, pixelwaarde-extractie en eigenschappen van eigenschappen.

Abstract

Pigmentatie is een morfologisch eenvoudig maar zeer variabel kenmerk dat vaak adaptieve betekenis heeft. Het heeft uitgebreid gediend als model om de ontwikkeling en evolutie van morfologische fenotypes te begrijpen. Abdominale pigmentatie in Drosophila melanogaster is bijzonder handig, zodat onderzoekers de loci kunnen identificeren die onderling en intraspecifieke variaties in morfologie liggen. Tot op heden is echter D. melanogaster buikpigmentatie grotendeels kwalitatief geanalyseerd, door middel van scoren, in plaats van kwantitatief, welke de vormen van statistische analyse beperken die op pigmentatiegegevens kan worden toegepast. Dit werk beschrijft een nieuwe methodologie die het mogelijk maakt om verschillende aspecten van het abdominale pigmentatiepatroon van volwassen D. melanogaster te kwantificeren . Het protocol bevat voorbeeldmontage, beeldopname, data-extractie en analyse. Alle software die wordt gebruikt voor macro-opnames en analysemogelijkhedenGeschreven voor open-source beeldanalyse. Het voordeel van deze aanpak is het vermogen om pigmentatiekenmerken nauwkeurig te meten met behulp van een methodologie die zeer reproducteerbaar is over verschillende beeldvormingssystemen. Hoewel de techniek is gebruikt om variatie in de tergal pigmentatiepatronen van volwassen D. melanogaster te meten , is de methodologie flexibel en breed toepasbaar op pigmentatiepatronen in veel verschillende organismen.

Introduction

Pigmentatie toont een enorme fenotypische variatie tussen soorten, populaties en individuen, en zelfs bij individuen tijdens ontogenie 1 , 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Hoewel er veel studies zijn over pigmentatie in een grote verscheidenheid aan dieren, is pigmentatie wellicht het beste bestudeerd in Drosophila melanogaster , waar de volledige kracht van de moleculaire genetica is gebruikt om de ontwikkelings- en fysiologische mechanismen die pigmentatie regelen en hoe deze mechanismen evolueren 1 toe te lichten , 6 . Er is veel bekend over de genen die de biochemische synthese van pigmenten regelen in D. melanogaster 7 , 8 en de genen die de temporale en ruimtelijke diVerdeling van deze biosynthese 9 , 10 , 11 , 12 , 13 . Bovendien heeft genetische mapping de genetische loci onderliggende intra- en interspecifieke verschillen in pigmentatie in D. melanogaster 14 , 15 , 16 , 17 geïdentificeerd . De relaties tussen pigmentatie en pleiotropische eigenschappen, zoals gedrag 18 , 19 en immuniteit 19 , 20 , zijn ook onderzocht, evenals de adaptieve betekenis van pigmentatiepatronen 15 , 21 , 22 . Als zodanig is pigmentatie in D. melanogaster ontstaan ​​als een krachtige maar simpele mOdel voor de ontwikkeling en evolutie van complexe fenotypes.

Pigmentatie in volwassen D. melanogaster wordt gekenmerkt door verschillende melanisatiepatronen over het lichaam, met name op de vleugels en dorsale thorax en buik. Het is de pigmentatie van elke cutikulaire plaat (tergiet) op de dorsale buik, maar dat heeft de meeste onderzoeks aandacht gekregen. Er is aanzienlijke variatie in deze pigmentatie ( Figuur 1A -F ), door beide genetische 17 , 23 en milieu 24 , 25 factoren. De kutikula van een buiktergiet bestaat uit voorste en achterste ontwikkelingscompartimenten ( Figuur 1G ), die elk verder onderverdeeld kunnen worden, afhankelijk van pigmentatie en versiering 26 . Het voorste compartiment bevat zes kutikulaTypen (a1-a6), en het achterste compartiment omvat drie (p1-p3) ( figuur 1G ). Van deze worden de p1-, p2- en a1-kutikula typisch gevouwen onder de tergiet in onuitgespreide abdomenen, zodat ze verborgen zijn. De betrouwbare zichtbare kutikula wordt gekenmerkt door een band met zware pigmentatie, hierna aangeduid als een pigmentband, bestaande uit kutikeltypes a4 (harig met matige borstels) en a5 (harig met grote borstels), met de achterste rand van de band Meer intensief gepigmenteerd dan de voorste rand ( figuur 1G ). Voorkant van deze band is een gebied van licht gepigmenteerde harige kutikula, die achterste achterkant (a3) ​​maar niet anterior (a2) heeft. Variatie in pigmentatie tussen vliegen wordt waargenomen in zowel de intensiteit van pigmentatie als in de breedte van de pigmentband. In het algemeen is variatie het grootste in de meest achterste segmenten (abdominale segmenten 5, 6 en 7) en is lager in de meer anterior segmenten (buikzeeGents 3 en 4) 24 . Verder is er een seksuele dimorfie in D. melanogaster pigmentatie, waarbij mannen meestal volledig gepigmenteerde vijfde en zesde buiktergieten hebben ( Figuur 4C ).

In de meeste studies van buikpigmentatie in D. melanogaster is pigmentatie behandeld als een categorische of ordinale eigenschap, waarbij het patroon kwalitatief 27 , 28 , 29 of semi-kwantitatief wordt gemeten op een schaal 14 , 15 , 16 , 17 , 24 , 30 31 , 32 , 33 , 34 , 3536 , 37 . Deze methoden hebben onvermijdelijk een gebrek aan precisie, en omdat ze vertrouwen op de subjectieve beoordeling van pigmentatie, is het moeilijk om de gegevens over studies te vergelijken. Verscheidene auteurs hebben de ruimtelijke dimensies van pigmentatie 38 , 39 gekwantificeerd, de intensiteit van pigmentatie van een bepaald kutikeltype 23 , 25 , 39 , 40 of de gemiddelde intensiteit van pigmentatie over de buiktergiet als geheel 41 , 42 , 43 . Desalniettemin meet deze kwantificatiewerkwijzen echter niet de intensiteit en de ruimtelijke verdeling van buikpigmentatie tegelijkertijd en derhalve niet de nuances van hoe pigmentatie varieert over de abdOminale tergiet Verder vereisen verscheidene van deze kwantificatiewerkwijzen 38 , 41 , 42 , 43 de dissectie en montage van de buikspieren. Dit is zowel tijdrovend en vernietigt het monster, waardoor het niet meer beschikbaar is voor aanvullende morfologische analyses. Aangezien het begrip van de ontwikkeling en evolutie van buikpigmentatie verdiept, zullen meer geavanceerde hulpmiddelen nodig zijn om snel en nauwkeurig zowel de ruimtelijke verdeling als de intensiteit van pigmentatie te meten.

Het algemene doel van deze methode is het gebruik van digitale beeldanalyse om een ​​replicabele en nauwkeuriger maatregel van de buikpigmentatie in D. melanogaster te verkrijgen . De methodologie omvat drie fasen. Ten eerste is de volwassen vlieg niet destructief gemonteerd en wordt een digitaal beeld van de dorsale buik genomen. Ten tweede, met behulp van een ImageJ macro, de gebruikerDefinieert een anterior-posterior strook pixels die zich uitstrekken van de voorkant van de a2-cuticle naar de achterkant van de a5-cuticle (groene doos, figuur 1G ) op zowel de derde als vierde buikspijkers. De gemiddelde pixelwaarde over de breedte van deze strip wordt vervolgens langs zijn lange as geëxtraheerd, waardoor een profiel wordt verkregen dat de ruimtelijke verdeling en intensiteit van pigmentatie vastlegt als het van de voorste naar de achterkant van de tergiet verandert. Ten derde wordt een R-script gebruikt om het pigmentatieprofiel wiskundig te beschrijven met behulp van een kubieke spline. Het R-script gebruikt dan de spline en zijn eerste en tweede afgeleide om de breedte van de a2-a5-kutikula, de breedte van de pigmentband en de maximale en minimumpigmenten van pigmentatie te extraheren. De methode kent dus zowel de ruimtelijke eigenschappen als de diepte van de buikpigmentatie.

Deze methodologie kwantificeert de pigmentatie van de derde en vierde abdominale tergieten,Die de focus zijn geweest van tal van eerdere studies 1 , 15 , 23 , 24 , 25 , 28 , 33 , 39 , 42 , ofwel uitsluitend of in combinatie met meer posterior tergieten. Hoewel minder variabel dan de vijfde en zesde abdominale tergieten, zijn de derde en vierde tergieten niet helemaal gepigmenteerd bij mannen, dus dit protocol kan zowel bij mannen als vrouwen worden toegepast. Desalniettemin, zoals hier getoond, kan het protocol worden gebruikt om pigmentatie in de vijfde en zesde buiktergieten bij vrouwen te meten. Bovendien moeten kleine wijzigingen van de scripts die gebruikt worden om de eigenschappen van het pigmentatieprofiel te extraheren, de methode toestaan ​​om de variatie in pigmentatie in een grote verscheidenheid aan andere te kwantificerenorganismen.

Protocol

1. Proefmontage OPMERKING: Bewaar dood vliegen in 70% ethanol in water voor afbeelden. Giet 10 ml 1,25% agar opgelost in kokend water in een 60 mm x 15 mm Petri-schotel en laat het instellen. Gebruik onder een dissectiemicroscoop een paar fijnpuntenpincen om een ​​~ 20 mm ong, 2 mm brede, 1 mm diepe groef in het oppervlak van de gel te maken. Gebruik fijne pincet, installeer de ventrale zijde van een volwassen vlieg in de groef, met de dorsale kant van de vlieg die b…

Representative Results

Het protocol werd gebruikt om het effect van de opslagtemperatuur op buikpigmentatie te onderzoeken. Uitgaande onderzoeken hebben aangetoond dat een toename van de ontwikkelingstemperatuur resulteert in een afname in de verspreiding van buikpigmentatie in verschillende soorten Drosophila , waaronder D. melanogaster 30 , 32 . Specifiek, in buiktergieten 3 en 4 neemt de mate van pigmentatie (breedte van de pigment…

Discussion

Deze methodologie zorgt voor de precieze, snelle en herhaalbare verwerving van pigmentatiegegevens in een kwantitatieve vorm die geschikt is voor meerdere downstream analyses. De methode is gebruikt om gegevens over het effect van temperatuur op buikpigmentatie in een isogene lijn vliegen te verwerven. De methodologie kan echter gebruikt worden in voorwaartse genetische studies om genen die onderliggende pigmentatieverschillen tussen individuen, populaties of soorten, of omgekeerde genetische studies zijn, te identifice…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dit werk werd gefinancierd door de National Science Foundation, verleent IOS-1256565 en IOS-1557638 aan AWS. We bedanken Patricia Wittkopp en drie anonieme recensenten voor hun nuttige opmerkingen over een eerdere versie van dit artikel.

Materials

Dumont #5 Biology Forceps FST 11252-30
Agar Sigma-Aldrich 5040
Dissecting Scope Leica MZ16FA
Base Leica MDG41
Camera Leica DFC280
Gooseneck Cold Light Source Schott ACE 1
Image Acquisition Control Software Micro-Manager v1.3.20 https://micro-manager.org/
Image Analysis Software ImageJ https://imagej.nih.gov/ij/
Data Analysis Software R 3.3.2 https://www.r-project.org/
LED Thor Labs LEDWE-15
Multimeter Fluke Fluke 75 Series II
60 x 15 mm Petri dish Celltreat Scientific Products 229663
Stage micrometer Klarman Rulings, Inc. KR-867
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wittkopp, P. J., Beldade, P. Development and evolution of insect pigmentation: Genetic mechanisms and the potential consequences of pleiotropy. Semin. Cell Dev. Biol. 20 (1), 65-71 (2009).
  2. Lindgren, J. Interpreting melanin-based coloration through deep time: a critical review. Proc Roy Soc B-Biol Sci. 282 (1813), (2015).
  3. Kronforst, M. R., Papa, R. The Functional Basis of Wing Patterning in Heliconius Butterflies: The Molecules Behind Mimicry. Genetics. 200 (1), 1-19 (2015).
  4. Albert, N. W., Davies, K. M., Schwinn, K. E. Gene regulation networks generate diverse pigmentation patterns in plants. Plant Signal Behav. 9, e29526 (2014).
  5. Monteiro, A. Origin, development, and evolution of butterfly eyespots. Annu Rev Entomol. 60, 253-271 (2015).
  6. Kronforst, M. R. Unraveling the thread of nature’s tapestry: the genetics of diversity and convergence in animal pigmentation. Pigm Cell Melanoma Res. 25 (4), 411-433 (2012).
  7. Wright, T. R. The genetics of biogenic amine metabolism, sclerotization, and melanization in Drosophila melanogaster. Adv Genet. 24, 127-222 (1987).
  8. True, J. R. Insect melanism: the molecules matter. TREE. 18 (12), 640-647 (2003).
  9. Kopp, A., Duncan, I. Control of cell fate and polarity in the adult abdominal segments of Drosophila by optomotor-blind. Development. 124 (19), 3715-3726 (1997).
  10. Kopp, A., Muskavitch, M. A., Duncan, I. The roles of hedgehog and engrailed in patterning adult abdominal segments of Drosophila. Development. 124 (19), 3703-3714 (1997).
  11. Kopp, A., Blackman, R. K., Duncan, I. Wingless, decapentaplegic and EGF receptor signaling pathways interact to specify dorso-ventral pattern in the adult abdomen of Drosophila. Development. 126 (16), 3495-3507 (1999).
  12. Kopp, A., Duncan, I., Godt, D., Carroll, S. B. Genetic control and evolution of sexually dimorphic characters in Drosophila. Nature. 408 (6812), 553-559 (2000).
  13. Williams, T. M. The regulation and evolution of a genetic switch controlling sexually dimorphic traits in Drosophila. Cell. 134 (4), 610-623 (2008).
  14. Wittkopp, P. J., Williams, B. L., Selegue, J. E., Carroll, S. B. Drosophila pigmentation evolution: divergent genotypes underlying convergent phenotypes. Proc Natl Acad Sci Usa. 100 (4), 1808-1813 (2003).
  15. Brisson, J. A., De Toni, D. C., Duncan, I., Templeton, A. R. Abdominal pigmentation variation in drosophila polymorpha: geographic variation in the trait, and underlying phylogeography. Evolution. 59 (5), 1046-1059 (2005).
  16. Brisson, J. A., Templeton, A. R., Duncan, I. Population genetics of the developmental gene optomotor-blind (omb) in Drosophila polymorpha: evidence for a role in abdominal pigmentation variation. Genetics. 168 (4), 1999-2010 (2004).
  17. Dembeck, L. M. Genetic Architecture of Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster. PLoS Genet. 11 (5), e1005163 (2015).
  18. Drapeau, M. D., Radovic, A., Wittkopp, P. J., Long, A. D. A gene necessary for normal male courtship, yellow, acts downstream of fruitless in the Drosophila melanogaster larval brain. J Neurobiol. 55 (1), 53-72 (2003).
  19. Hodgetts, R. B., O’Keefe, S. L. Dopa decarboxylase: a model gene-enzyme system for studying development, behavior, and systematics. Annu Rev Entomol. 51, 259-284 (2006).
  20. Marmaras, V. J., Charalambidis, N. D., Zervas, C. G. Immune response in insects: the role of phenoloxidase in defense reactions in relation to melanization and sclerotization. Arch Insect Biochem Physiol. 31 (2), 119-133 (1996).
  21. Kalmus, H. The Resistance to Desiccation of Drosophila Mutants Affecting Body Colour. Proc Roy Soc London B. 130 (859), 185-201 (1941).
  22. Rajpurohit, S., Gibbs, A. G. Selection for abdominal tergite pigmentation and correlated responses in the trident: a case study in Drosophila melanogaster. Biol J Linn Soc. 106 (2), 287-294 (2012).
  23. Pool, J. E., Aquadro, C. F. The genetic basis of adaptive pigmentation variation in Drosophila melanogaster. Mol Ecol. 16 (14), 2844-2851 (2007).
  24. Gibert, P., Moreteau, B., David, J. R. Developmental constraints on an adaptive plasticity: reaction norms of pigmentation in adult segments of Drosophila melanogaster. Evol Dev. 2 (5), 249-260 (2000).
  25. Shakhmantsir, I., Massad, N. L., Kennell, J. A. Regulation of cuticle pigmentation in drosophila by the nutrient sensing insulin and TOR signaling pathways. Dev Dyn. 243 (3), 393-401 (2014).
  26. Struhl, G., Barbash, D. A., Lawrence, P. A. Hedgehog organises the pattern and polarity of epidermal cells in the Drosophila abdomen. Development. 124 (11), 2143-2154 (1997).
  27. Jeong, S., Rokas, A., Carroll, S. B. Regulation of body pigmentation by the Abdominal-B Hox protein and its gain and loss in Drosophila evolution. Cell. 125 (7), 1387-1399 (2006).
  28. Wittkopp, P. J., True, J. R., Carroll, S. B. Reciprocal functions of the Drosophila yellow and ebony proteins in the development and evolution of pigment patterns. Development. 129 (8), 1849-1858 (2002).
  29. True, J. R. Drosophila tan encodes a novel hydrolase required in pigmentation and vision. PLoS Genet. 1 (5), e63 (2005).
  30. David, J. R., Capy, P., Gauthier, J. P. Abdominal pigmentation and growth temperature in Drosophila melanogaster: Similarities and differences in the norms of reaction of successive segments. J Evol Biol. 3 (5-6), (1990).
  31. Gibert, J. M., Peronnet, F., Schlotterer, C. Phenotypic plasticity in Drosophila pigmentation caused by temperature sensitivity of a chromatin regulator network . PLoS Genet. 3 (2), e30 (2007).
  32. Gibert, P., Moreteau, B., Scheiner, S. M. Phenotypic plasticity of body pigmentation in Drosophila: correlated variations between segments. Genet Sel Evol. 30 (2), 181 (1998).
  33. Matute, D. R., Harris, A. The influence of abdominal pigmentation on desiccation and ultraviolet resistance in two species of Drosophila. Evolution. 67 (8), 2451-2460 (2013).
  34. Das, A., Mohanty, S., Parida, B. Abdominal pigmentation and growth temperature in Indian Drosophila melanogaster: Evidence for genotype-environment interaction. J Biosci. 19 (2), 267-275 (1994).
  35. Hollocher, H., Hatcher, J. L., Dyreson, E. G. Evolution of abdominal pigmentation differences across species in the Drosophila dunni subgroup. Evolution. 54 (6), 2046-2056 (2000).
  36. Gibert, P., Moreteau, B., David, J. R. Phenotypic plasticity of body pigmentation in Drosophila melanogaster: genetic repeatability of quantitative parameters in two successive generations. Heredity. 92 (6), 499-507 (2004).
  37. Carbone, M. A., Llopart, A., deAngelis, M., Coyne, J. A., Mackay, T. F. Quantitative trait loci affecting the difference in pigmentation between Drosophila yakuba and D. santomea. Genetics. 171, 211-225 (2005).
  38. Kopp, A., Graze, R. M., Xu, S., Carroll, S. B., Nuzhdin, S. V. Quantitative trait loci responsible for variation in sexually dimorphic traits in Drosophila melanogaster. Genetics. 163 (2), 771-787 (2003).
  39. Bastide, H., Yassin, A., Johanning, E. J., Pool, J. E. Pigmentation in Drosophila melanogaster reaches its maximum in Ethiopia and correlates most strongly with ultra-violet radiation in sub-Saharan Africa. BMC Evol Biol. 14, 179 (2014).
  40. Rebeiz, M., Pool, J. E., Kassner, V. A., Aquadro, C. F., Carroll, S. B. Stepwise modification of a modular enhancer underlies adaptation in a Drosophila population. Science. 326 (5960), 1663-1667 (2009).
  41. John, A. V., Sramkoski, L. L., Walker, E. A., Cooley, A. M., Wittkopp, P. J. Sensitivity of Allelic Divergence to Genomic Position: Lessons from the Drosophila tan Gene. G3. 6 (9), 2955-2962 (2016).
  42. Wittkopp, P. J. Local adaptation for body color in Drosophila americana. Heredity. 106 (4), 592-602 (2011).
  43. Wittkopp, P. J. Intraspecific polymorphism to interspecific divergence: genetics of pigmentation in Drosophila. Science. 326 (5952), 540-544 (2009).
  44. Edelstein, A. D. Advanced methods of microscope control using µManager software. Journal of Biological Methods. 1 (2), e10 (2014).
  45. . ImageJ v.1.50i Available from: https://imagej.nih.gov/ij/ (2016)
  46. Mims, F. M. How to Use LEDs to Detect Light. Make:. 36, 136-138 (2013).
  47. R: Language and Environment for Statistical Computing v.3.3.2. R Foundation for Statistical Computing Available from: https://www.r-project.org/ (2016)
  48. Bates, D., Machler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. Fitting Linear Mixed-Effects Models Using lme4. Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).
  49. Shingleton, A. W., Estep, C. M., Driscoll, M. V., Dworkin, I. Many ways to be small: different environmental regulators of size generate distinct scaling relationships in Drosophila melanogaster. Proc Roy Soc Lond B Biol Sci. 276 (1667), 2625-2633 (2009).
  50. French, V., Feast, M., Partridge, L. Body size and cell size in Drosophila: the developmental response to temperature. J Insect Physiol. 44 (11), 1081-1089 (1998).
  51. Houle, D., Govindaraju, D. R., Omholt, S. Phenomics: the next challenge. Nat Rev Genet. 11 (12), 855-866 (2010).
  52. Kültz, D. New frontiers for organismal biology. BioSci. 63 (6), 464-471 (2013).

Tags

Keywords: Abdominal PigmentationDrosophila MelanogasterEvolutionary BiologyMorphological PhenotypesNon-destructive MeasurementPigmentation PatternsInsectsAnimal TaxaMounting PadAgar GelMicroscope ImagingDigital CameraImage Analysis SoftwareGrayscaleLight SourceStage MicrometerScale Calibration
check_url/55732?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Saleh Ziabari, O., Shingleton, A. W. Quantifying Abdominal Pigmentation in Drosophila melanogaster. J. Vis. Exp. (124), e55732, doi:10.3791/55732 (2017).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image