Preparação de Vesículas de Membranas Plasmáticas de Células-Tronco Mesenquimais de Medula Óssea para Terapia Potencial de Substituição de Citoplasma
Summary
As doenças relacionadas à idade estão associadas a múltiplos defeitos nos componentes do citoplasma. Aqui, apresentamos um protocolo para preparar vesículas de membranas plasmáticas de células estaminais mesenquimais de medula óssea. Esta técnica poderia potencialmente ser utilizada como um meio de terapia de substituição do citoplasma para melhorar ou mesmo reverter fenotipos associados à idade.
Abstract
Nós já relatamos sobre a geração de vesículas de membrana plasmática (PMVs) através da extrusão mecânica de células de mamíferos. A fusão de PMVs com células RhoO deficientes mitocondriais restaurou a actividade mitótica em condições de cultura normais. A aterosclerose, diabetes tipo 2, doença de Alzheimer e cancro são doenças relacionadas com a idade que foram relatadas como estando associadas a múltiplos defeitos mecânicos e funcionais no citosol e organelas de uma variedade de tipos de células. As células-tronco mesenquimais da medula óssea (BMSCs) representam uma população única de células da medula óssea que possuem capacidades de auto-renovação, mantendo a sua multipotência. A suplementação de células de senescência com citoplasma jovem a partir de BMSCs autólogas através da fusão de PMVs proporciona uma abordagem promissora para melhorar ou mesmo reverter fenotipos associados à idade. Este protocolo descreve como preparar PMVs de BMSCs através de extrusão através de uma membrana de policarbonato com 3Determinam a existência de mitocôndrias e examinam a manutenção do potencial de membrana dentro de PMVs usando um microscópio confocal, concentram PMVs por centrifugação e realizam a injeção in vivo de PMVs no músculo gastrocnêmio de camundongos.
Introduction
Uma enorme quantidade de esforço tem sido dedicada ao estabelecimento de abordagens para genes, enzimas e terapias de reposição celular. Isto resultou em grandes avanços e mesmo aplicações clínicas 1 , 2 , 3 . Recentemente, uma polêmica mitocôndria substituição terapia baseada em tecnologia de transferência de núcleo foi aplicado à fertilização in vitro para mulheres de idade avançada ou portador de uma mitocondrial letal DNA mutação [ 4] . Defeitos encontrados em doenças relacionadas à idade, incluindo aterosclerose, diabetes tipo 2, doença de Alzheimer e câncer, são geralmente multifacetados. Tem sido documentado que a acumulação de gotículas lipídicas; A deposição de proteína amilóide; A retenção de proteínas desdobradas no retículo endoplasmático; E proteassoma defeituoso, autofagosoma e mitocôndrias contribuem para o desenvolvimento ou agravamento destas doenças"Xref"> 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Actualmente, não existe nenhum mecanismo disponível destinado a remediar directamente o mau funcionamento no citosol e organelas, o que provoca a senescência e os fenótipos de envelhecimento.
Nós já relatamos sobre a geração de vesículas de membrana plasmática (PMVs) através da extrusão mecânica de células de mamíferos 12 . Com exceção do núcleo, componentes em membrana ou citosol, incluindo proteínas e RNA, bem como as organelas, como mitocôndrias, foram encontrados em PMVs. Essencialmente, um PMV pode ser considerado como uma célula enucleada em miniatura. Mais importante ainda, a fusão de PMVs com células RhoO deficientes em mitocôndrias restaurou a actividade mitótica em condições de cultura normais. Este é o primeiro relatório sobreUma abordagem potencialmente eficiente para a terapia de substituição do citoplasma.
As células estaminais mesenquimais da medula óssea (BMSCs) são células progenitoras multipotentes que são rotineiramente geradas a partir da medula óssea e são facilmente expandidas em cultura. Marcadores de células estaminais embrionárias Oct4, Nanog e SOX2 foram detectados em baixos níveis em MSCs 13 . A actividade de telomerase também é mensurável. Além disso, a ausência de moléculas co-estimuladoras e moléculas de antígeno leucocitário humano (HLA) de classe II, bem como a baixa expressão de HLA Classe I em MSCs, tornam-se células ideais para uso alogênico ou "off-the-shelf" Tanto a medicina regenerativa quanto as aplicações imunomoduladoras 14 .
Aqui, descrevemos como preparar PMVs de BMSCs de ratos por extrusão através de uma membrana de policarbonato com poros de 3 μm, determinar a existência de mitocôndrias e examinar a manutenção do potencial de membrana em PMVs usando confocAl microscopia, preparar PMVs concentrados mas não agregados por centrifugação e realizar a injeção in vivo de PMVs no músculo gastrocnêmio de camundongos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cytoplasm replacement therapy as proposed in this manuscript has unique advantages over other reported approaches such as gene, molecular, and cell therapy. PMVs generated from BMSCs encapsulate not only the products of stemness genes but also intact cellular organelles, which are essential to remedy the ageing phenotypes associated with senescence. When young cytoplasm is delivered to senescent cells, the malfunctioning mechanisms may gain a brief relief; at the same time, the epigenome could be reprogrammed and invigor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Esta pesquisa foi apoiada pela Fundação Li Ka Shing, o Projeto de Universidade de Alto Nível de Guangdong "Tecnologias Verdes para Indústrias Marinhas", a Fundação de Ciências Naturais da China (http://www.nsfc.gov.cn/ Grant No. 30971665, 81172894, 81370925), e o Departamento de Educação de Guangdong (http://www.gdhed.edu.cn/ Grant No.cxzd1123).
Materials
| IsoporeTM membranes | Millipore | TSTP04700 | 3 mm pore |
| Disposable filter unit | Xinya, Shanghai, China | 25 mm | Medical grade polypropylene |
| Insulin syringe | BD | 328446 | 1 ml |
| pN1-EGFP | Clontech | 6085-1 | |
| MitoTracker | Molecular Probes | M7514 | Green FM, 1 μM |
| JC-1 | Beyotime, Haimen, China | C2006 | 10 mg/ml |
| CM-DiI | Beyotime, Haimen, China | C1036 | 10 mM |
| PEI | Sigma | P3143 | Mn = 75000 |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE 2000 | With CCD camera |
| Confocol Microscope | Carl Zeiss | LSM 510 Meta | |
| PolyJet | SigaGen | SL100688 | For cell transfection |
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