Potansiyel Sitoplazma Replasman Tedavisi için Kemik İliği Mezenkimal Kök Hücrelerinden Plazma Membran Vesiküllerinin Hazırlanması
Summary
Yaşa bağlı hastalıklar, sitoplazmadaki bileşenlerin birden fazla kusuru ile ilişkilidir. Burada, kemik iliği mezenkimal kök hücrelerinden plazma membran veziküller hazırlamak için bir protokol sunuyoruz. Bu teknik yaşla ilişkili fenotipleri iyileştirmek veya hatta tersine çevirmek için sitoplazma replasman tedavisi aracı olarak potansiyel olarak kullanılabilir.
Abstract
Daha önce, memeli hücrelerinin mekanik ekstrüzyonu yoluyla plazma zar veziküllerinin (PMV'ler) üretimini bildirdik. PMV'lerin mitokondriyal yetersiz Rho0 hücreleri ile birleşmesi, normal kültür koşullarında mitotik aktiviteyi geri kazandırdı. Ateroskleroz, tip 2 diyabet, Alzheimer hastalığı ve kanser, çeşitli hücre tiplerinin sitolol ve organellerinde çok sayıda mekanik ve fonksiyonel kusur ile ilişkili olduğu bildirilen yaşa bağlı hastalıklardır. Kemik iliği mezenkimal kök hücreleri (BMSC'ler), kendi çoktanlıklarını korurken kendi kendini yenileme kabiliyetlerine sahip olan kemik iliğinden gelen benzersiz bir hücre popülasyonunu temsil eder. Yaşlanmayı önleyici hücrelerin, otolog BMSC'lerden genç sitoplazması ile PMV'lerin füzyonu yoluyla eklenmesi, yaşa bağlı fenotiplerin iyileştirilmesi veya hatta tersine çevrilmesi için umut verici bir yaklaşım sağlar. Bu protokol, 3'lü polikarbonat membran içinden ekstrüzyon yoluyla BMSC'lerden PMV'lerin nasıl hazırlanacağını açıklamaktadır.1 gözenekleri, mitokondri varlığını belirlemek ve bir konfokal mikroskop kullanarak PMV'ler içinde zar potansiyelinin bakımı incelemek, santrifüj ile PMVs konsantre ve farelerin gastroknemius kas içine PMVs in vivo enjeksiyonu gerçekleştirmek.
Introduction
Gen, enzim ve hücre replasman tedavileri için yaklaşımlar oluşturmak için büyük çaba harcandı. Bu, büyük ilerlemeler ve hatta klinik uygulamalarla sonuçlandı 1 , 2 , 3 . Yakın zamanda, yaşlı kadınların veya ölümcül mitokondriyal DNA mutasyonu taşıyan in vitro döllenmeye çekirdek transfer teknolojisine dayalı tartışmalı bir mitokondria replasman tedavisi uygulanmıştır4. Ateroskleroz, tip 2 diyabet, Alzheimer hastalığı ve kanser gibi yaşla ilişkili hastalıklarda bulunan kusurlar genellikle çok yönlüdür. Lipid damlacıklarının birikiminin; Amiloid proteinin birikimi; Açılmış proteinlerin endoplazmik retikulumda tutulması; Ve arızalı proteazom, otofagozom ve mitokondri bu hastalıkların gelişimine veya şiddetlenmesine katkıda bulunur"Xref"> 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . Halen, yaşlanmaya ve yaşlanmaya neden olan fenotiplere neden olan sitozol ve organellerde arızanın doğrudan düzeltilmesini amaçlayan herhangi bir mekanizma mevcut değildir.
Daha önce, memeli hücrelerinin mekanik ekstrüzyonu yoluyla plazma zar veziküllerinin (PMV'lerin) üretimini bildirdik 12 . Çekirdek dışında, PMV'lerde protein ve RNA da dahil olmak üzere zar veya sitoplazmadaki bileşenlerin yanı sıra mitokondri gibi organel bileşikleri de bulundu. Esasen, bir PMV minyatür enükleated hücre olarak kabul edilebilir. Daha da önemlisi, PMV'lerin mitokondriyal eksik Rho0 hücreleri ile birleşmesi, normal kültür koşulları altında mitotik aktiviteyi geri kazandırdı. Bu, establi hakkındaki ilk rapordur.Sitoplazma replasman tedavisi için potansiyel olarak verimli bir yaklaşım savunur.
Kemik iliği mezenkimal kök hücreleri (BMSC'ler), kemik iliğinden rutin olarak üretilen ve kültürde kolaylıkla genişleyen multipotent progenitör hücrelerdir. Embriyonik kök hücre markörleri Oct4, Nanog ve SOX2 MSC'lerde düşük seviyelerde tespit edildi 13 . Telomeraz etkinliği de ölçülebilirdir. Buna ek olarak, yardımcı uyarıcı moleküller ve insan lökosit antijeni (HLA) Sınıf II moleküllerinin yanı sıra MSC'lerde düşük HLA Sınıf I ifadesi bulunmadığından, bunları allojenik veya "raflarda" kullanım için ideal hücreler haline getirir Hem rejeneratif tıp hem de immünomodülatör uygulamalar 14 .
Burada, 3-μm gözenekli bir polikarbonat zar yoluyla ekstrüzyon yoluyla fare BMSC'lerden PMV'lerin nasıl hazırlanacağını, PMV'lerde mitokondri varlığını belirleyip, confoc kullanarak PMV'lerin bakımını inceliyoruz.Konsantre fakat agregasyonsuz PMV'leri santrifüjleme ile hazırlayın ve PMV'lerin farelerin gastroknemius kütlesine in vivo enjeksiyonu gerçekleştirin.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cytoplasm replacement therapy as proposed in this manuscript has unique advantages over other reported approaches such as gene, molecular, and cell therapy. PMVs generated from BMSCs encapsulate not only the products of stemness genes but also intact cellular organelles, which are essential to remedy the ageing phenotypes associated with senescence. When young cytoplasm is delivered to senescent cells, the malfunctioning mechanisms may gain a brief relief; at the same time, the epigenome could be reprogrammed and invigor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, Li Ka Shing Vakfı, Guangdong Yüksek Düzeyli Üniversite Projesi "Deniz Teknolojileri için Yeşil Teknolojiler", Çin Doğa Bilimleri Vakfı (http://www.nsfc.gov.cn/ Grant No. 30971665, 81172894, 81370925) ve Guangdong Eğitim Bölümü (http://www.gdhed.edu.cn/ Grant No.cxzd1123).
Materials
| IsoporeTM membranes | Millipore | TSTP04700 | 3 mm pore |
| Disposable filter unit | Xinya, Shanghai, China | 25 mm | Medical grade polypropylene |
| Insulin syringe | BD | 328446 | 1 ml |
| pN1-EGFP | Clontech | 6085-1 | |
| MitoTracker | Molecular Probes | M7514 | Green FM, 1 μM |
| JC-1 | Beyotime, Haimen, China | C2006 | 10 mg/ml |
| CM-DiI | Beyotime, Haimen, China | C1036 | 10 mM |
| PEI | Sigma | P3143 | Mn = 75000 |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE 2000 | With CCD camera |
| Confocol Microscope | Carl Zeiss | LSM 510 Meta | |
| PolyJet | SigaGen | SL100688 | For cell transfection |
References
- Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. Enhanced gene transfer with fusogenic liposomes containing vesicular stomatitis virus G glycoprotein. J Virol. 72 (7), 6159-6163 (1998).
- Dolatabadi, J., Valizadeh, H., Hamishehkar, H. Solid lipid nanoparticles as efficient drug and gene delivery systems: recent breakthroughs. Adv Pharm Bull. 5 (2), 151-159 (2015).
- Torchilin, V. P. Multifunctional, stimuli-sensitive nanoparticulate systems for drug delivery. Nat Rev Drug Discov. 13 (11), 813-827 (2014).
- Wolf, D. P., Mitalipov, N., Mitalipov, S. Mitochondrial replacement therapy in reproductive medicine. Trends Mol Med. 21 (2), 68-76 (2015).
- López-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
- Plakkal, J., Paul, A. A., Goo, Y. H. Lipid droplet-associated proteins in atherosclerosis. Mol Med Rep. 13 (6), 4527-4534 (2016).
- Hoppener, J. W. M., Ahren, B., Lips, C. J. M. Islet amyloid and type 2 diabetes mellitus. N Engl J Med. 343 (6), 411-419 (2000).
- Jagust, W. Is amyloid-β harmful to the brain? Insights from human imaging studies. Brain. 139 (Pt 1), 23-30 (2016).
- Naidoo, N. The endoplasmic reticulum stress response and aging. Rev Neurosci. 20 (1), 23-37 (2009).
- Cuervo, A. M. Autophagy and aging: keeping that old broom working. Trends Genet. 24 (12), 604-612 (2008).
- Bratic, A., Larsson, N. G. The role of mitochondria in aging. J Clin Invest. 123 (3), 951-957 (2013).
- Lin, H. P., et al. Incorporation of VSV-G produces fusogenic plasma membrane vesicles capable of efficient transfer of bioactive macromolecules and mitochondria. Biomed Microdevices. 18 (3), 41 (2016).
- Riekstina, U., et al. Embryonic stem cell marker expression pattern in human mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, heart and dermis. Stem Cell Rev. 5 (4), 378-386 (2009).
- Purandare, B., Teklemariam, T., Zhao, L. M., Hantash, B. M. Temporal HLA profiling and immunomodulatory effects of human adult bone marrow- and adipose-derived mesenchymal stem cells. Regen Med. 9 (1), 67-79 (2014).
- Nemeth, K., Mayer, B., Sworder, B. J., Kuznetsov, S. A., Mezey, E. A practical guide to culturing mouse and human bone marrow stromal cells. Curr Protoc Immunol. 102, (2013).
- Shahabipour, F., et al. Exosomes: Nanoparticulate tools for RNA interference and drug delivery. J Cell Physiol. , (2017).
- Lamichhane, T. N., et al. Emerging roles for extracellular vesicles in tissue engineering and regenerative medicine. Tissue Eng B. 21 (1), 45-54 (2015).
- Baumgart, T., et al. Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles. Proc Natl Acad Sci. 104 (9), 3165-3170 (2007).
- Sezgin, E., et al. Elucidating membrane structure and protein behavior using giant plasma membrane vesicles. Nat Protoc. 7 (6), 1042-1051 (2012).
- Lingwood, D., Ries, J., Schwille, P., Simons, K. Plasma membranes are poised for activation of raft phase coalescence at physiological temperature. Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10005-10010 (2008).
- Pandey, A. P., Sawant, K. K. Polyethylenimine: A versatile, multifunctional non-viral vector for nucleic acid delivery. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 68, 904-918 (2016).
