Framställning av plasmamembranvesiklar från benmärgs mesenkymala stamceller för potentiell cytoplasm ersättningsterapi
Summary
Åldersrelaterade sjukdomar är förknippade med flera defekter i komponenterna i cytoplasman. Här presenterar vi ett protokoll för att förbereda plasmamembranvesiklar från benmärgs mesenkymala stamceller. Denna teknik kan potentiellt användas som ett medel för cytoplasmersättningsterapi för att förbättra eller till och med omvänt åldersrelaterade fenotyper.
Abstract
Vi har tidigare rapporterat om generering av plasmamembranvesiklar (PMV) genom mekanisk extrusion av däggdjursceller. Sammansmältningen av PMV med mitokondriella defekta Rho0-celler återställde mitotisk aktivitet under normala odlingsbetingelser. Ateroskleros, typ 2-diabetes, Alzheimers sjukdom och cancer är åldersrelaterade sjukdomar som har rapporterats vara förknippade med flera mekaniska och funktionella defekter i cytosolen och organellerna i olika celltyper. Benmärgs mesenkymala stamceller (BMSCs) representerar en unik cellpopulation från benmärgen som har självförnyelsekapacitet samtidigt som den behåller sin multipotens. Kompletteringen av senescensceller med ung cytoplasma från autologa BMSC via fusion av PMV ger ett lovande tillvägagångssätt för att förbättra eller till och med omvänt åldersrelaterade fenotyper. Detta protokoll beskriver hur man förbereder PMVs från BMSCs via extrudering genom ett polykarbonatmembran med 31; m porer, bestämma förekomsten av mitokondrier och undersöka upprätthållandet av membranpotentialen inom PMV med användning av ett konfokalt mikroskop, koncentrera PMVs genom centrifugering och genomföra in vivo injektion av PMV i muskels gastrocnemiusmuskel.
Introduction
En enorm mängd ansträngningar har ägnats åt att etablera tillvägagångssätt för gen-, enzym- och cellbytesterapier. Detta har resulterat i stora genombrott och till och med kliniska tillämpningar 1 , 2 , 3 . Nyligen applicerades en kontroversiell mitokondri-ersättningsbehandling baserad på kärnöverföringsteknik på in vitro fertilisering för kvinnor i ålderdom eller med en dödlig mitokondriell DNA-mutation 4 . Brister som finns i åldersrelaterade sjukdomar, inklusive ateroskleros, typ 2-diabetes, Alzheimers sjukdom och cancer, är vanligtvis mångfacetterade. Det har dokumenterats att ackumulering av lipiddroppar; Depositionen av amyloidprotein; Retentionen av utfällda proteiner i endoplasmatisk retikulum; Och defekt proteasom, autofagosom och mitokondrier bidrar till utvecklingen eller förvärringen av dessa sjukdomar"Xref"> 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 . För närvarande finns det ingen tillgänglig mekanism som syftar till direkt remediering av fel i cytosolen och organellerna, vilket orsakar senescens och åldrande fenotyper.
Vi har tidigare rapporterat om generering av plasmamembranvesiklar (PMV) genom mekanisk extrusion av däggdjursceller 12 . Med undantag av kärnan hittades komponenter i membranet eller cytosolen, inklusive proteiner och RNA, liksom organellerna, såsom mitokondrier, i PMV. I huvudsak kan en PMV betraktas som en miniatyr enukleerad cell. Ännu viktigare återställde sammansmältningen av PMV med mitokondria-bristande Rho0-celler mitotisk aktivitet under normala odlingsbetingelser. Detta är den första rapporten om establiSkänka ett potentiellt effektivt tillvägagångssätt för cytoplasmersättningsterapi.
Benmärgs mesenkymala stamceller (BMSCs) är multipotenta stamceller som genereras rutinmässigt från benmärgen och expanderas lätt i odling. Embryonala stamcellsmarkörer Okt4, Nanog och SOX2 har detekterats vid låga nivåer i MSCs 13 . Telomerasaktivitet är också mätbar. Dessutom gör frånvaron av samstimulerande molekyler och humana leukocytantigen (HLA) klass II-molekyler, såväl som lågt HLA-klass I-uttryck på MSC, dem som ideala celler för allogen eller "off-the-shelf" användning i Både regenerativ medicin och immunmodulerande applikationer 14 .
Här beskriver vi hur man förbereder PMV från mus-BMSCs via extrudering genom ett polykarbonatmembran med 3 μm porer, bestämmer förekomsten av mitokondrier och undersöker underhållet av membranpotentialen i PMVs med hjälp av confocAl mikroskopi, förbereda koncentrerade men ej aggregerade PMV genom centrifugering och genomföra in vivo injektion av PMV i muskels gastrocnemius muskeln.
Protocol
Representative Results
Discussion
Cytoplasm replacement therapy as proposed in this manuscript has unique advantages over other reported approaches such as gene, molecular, and cell therapy. PMVs generated from BMSCs encapsulate not only the products of stemness genes but also intact cellular organelles, which are essential to remedy the ageing phenotypes associated with senescence. When young cytoplasm is delivered to senescent cells, the malfunctioning mechanisms may gain a brief relief; at the same time, the epigenome could be reprogrammed and invigor…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av Li Ka Shing Foundation, Guangdong High Level University Project "Gröna Technologies for Marine Industries", Natural Science Foundation of China (http://www.nsfc.gov.cn/ Grant No. 30971665, 81172894, 81370925) och Education Department of Guangdong (http://www.gdhed.edu.cn/ Grant No.cxzd1123).
Materials
| IsoporeTM membranes | Millipore | TSTP04700 | 3 mm pore |
| Disposable filter unit | Xinya, Shanghai, China | 25 mm | Medical grade polypropylene |
| Insulin syringe | BD | 328446 | 1 ml |
| pN1-EGFP | Clontech | 6085-1 | |
| MitoTracker | Molecular Probes | M7514 | Green FM, 1 μM |
| JC-1 | Beyotime, Haimen, China | C2006 | 10 mg/ml |
| CM-DiI | Beyotime, Haimen, China | C1036 | 10 mM |
| PEI | Sigma | P3143 | Mn = 75000 |
| Fluorescence Microscope | Nikon | Eclipse TE 2000 | With CCD camera |
| Confocol Microscope | Carl Zeiss | LSM 510 Meta | |
| PolyJet | SigaGen | SL100688 | For cell transfection |
References
- Abe, A., Miyanohara, A., Friedmann, T. Enhanced gene transfer with fusogenic liposomes containing vesicular stomatitis virus G glycoprotein. J Virol. 72 (7), 6159-6163 (1998).
- Dolatabadi, J., Valizadeh, H., Hamishehkar, H. Solid lipid nanoparticles as efficient drug and gene delivery systems: recent breakthroughs. Adv Pharm Bull. 5 (2), 151-159 (2015).
- Torchilin, V. P. Multifunctional, stimuli-sensitive nanoparticulate systems for drug delivery. Nat Rev Drug Discov. 13 (11), 813-827 (2014).
- Wolf, D. P., Mitalipov, N., Mitalipov, S. Mitochondrial replacement therapy in reproductive medicine. Trends Mol Med. 21 (2), 68-76 (2015).
- López-Otin, C., Blasco, M. A., Partridge, L., Serrano, M., Kroemer, G. The hallmarks of aging. Cell. 153 (6), 1194-1217 (2013).
- Plakkal, J., Paul, A. A., Goo, Y. H. Lipid droplet-associated proteins in atherosclerosis. Mol Med Rep. 13 (6), 4527-4534 (2016).
- Hoppener, J. W. M., Ahren, B., Lips, C. J. M. Islet amyloid and type 2 diabetes mellitus. N Engl J Med. 343 (6), 411-419 (2000).
- Jagust, W. Is amyloid-β harmful to the brain? Insights from human imaging studies. Brain. 139 (Pt 1), 23-30 (2016).
- Naidoo, N. The endoplasmic reticulum stress response and aging. Rev Neurosci. 20 (1), 23-37 (2009).
- Cuervo, A. M. Autophagy and aging: keeping that old broom working. Trends Genet. 24 (12), 604-612 (2008).
- Bratic, A., Larsson, N. G. The role of mitochondria in aging. J Clin Invest. 123 (3), 951-957 (2013).
- Lin, H. P., et al. Incorporation of VSV-G produces fusogenic plasma membrane vesicles capable of efficient transfer of bioactive macromolecules and mitochondria. Biomed Microdevices. 18 (3), 41 (2016).
- Riekstina, U., et al. Embryonic stem cell marker expression pattern in human mesenchymal stem cells derived from bone marrow, adipose tissue, heart and dermis. Stem Cell Rev. 5 (4), 378-386 (2009).
- Purandare, B., Teklemariam, T., Zhao, L. M., Hantash, B. M. Temporal HLA profiling and immunomodulatory effects of human adult bone marrow- and adipose-derived mesenchymal stem cells. Regen Med. 9 (1), 67-79 (2014).
- Nemeth, K., Mayer, B., Sworder, B. J., Kuznetsov, S. A., Mezey, E. A practical guide to culturing mouse and human bone marrow stromal cells. Curr Protoc Immunol. 102, (2013).
- Shahabipour, F., et al. Exosomes: Nanoparticulate tools for RNA interference and drug delivery. J Cell Physiol. , (2017).
- Lamichhane, T. N., et al. Emerging roles for extracellular vesicles in tissue engineering and regenerative medicine. Tissue Eng B. 21 (1), 45-54 (2015).
- Baumgart, T., et al. Large-scale fluid/fluid phase separation of proteins and lipids in giant plasma membrane vesicles. Proc Natl Acad Sci. 104 (9), 3165-3170 (2007).
- Sezgin, E., et al. Elucidating membrane structure and protein behavior using giant plasma membrane vesicles. Nat Protoc. 7 (6), 1042-1051 (2012).
- Lingwood, D., Ries, J., Schwille, P., Simons, K. Plasma membranes are poised for activation of raft phase coalescence at physiological temperature. Proc Natl Acad Sci. 105 (29), 10005-10010 (2008).
- Pandey, A. P., Sawant, K. K. Polyethylenimine: A versatile, multifunctional non-viral vector for nucleic acid delivery. Mater Sci Eng C Mater Biol Appl. 68, 904-918 (2016).
