Vorübergehende Expression und zelluläre Lokalisation von rekombinanten Proteinen in gezüchteten Insektenzellen

Summary

Nichtlysierende Insektenzellexpressionssysteme sind für die Produktion, Zellmigration / Lokalisierung und rekombinante Protein funktionelle Analyse nicht ausgelastet. Hier beschreiben wir Verfahren, Expressionsvektoren und nachfolgende transiente Proteinexpression in kommerziell erhältlichen Lepidoptera-Zelllinien zu erzeugen. Die Co-Lokalisierung von Bemisia tabaci aquaporins mit subzellulären fluoreszierenden Markerproteinen wird ebenfalls vorgestellt.

Abstract

Heterologe Proteinexpressionssysteme sind für die Herstellung rekombinanter Proteine ​​verwendet werden, die Interpretation von zellulärem Handel / Lokalisierung und die Bestimmung der biochemischen Funktion von Proteinen an der Unter organismal Ebene. Obwohl Baculovirus-Expressionssysteme werden zunehmend für die Proteinproduktion in zahlreichen biotechnologischen, pharmazeutischen und industriellen Anwendungen, nichtlysierende Systemen verwendet, die nicht virale Infektion haben klare Vorteile beinhalten sie sind aber oft übersehen und nicht ausgelastet. Hier beschreiben wir ein Verfahren zum Erzeugen nichtlysierende Expressionsvektoren und transiente Expression von rekombinantem Protein. Dieses Protokoll ermöglicht die effiziente zelluläre Lokalisation von rekombinanten Proteinen und kann verwendet werden, um schnell den Proteintransport in der Zelle zu unterscheiden. Wir zeigen die Expression von vier rekombinanten Proteinen in einer handelsüblichen Insektenzelllinie, einschließlich zwei Aquaporin – Proteine aus dem Insekten Bemisia tabaci, sowieals subzellulären Markerproteine ​​spezifisch für die Zellplasmamembran und für die intrazelluläre Lysosomen. Alle rekombinanten Proteine ​​wurden als Chimären mit fluoreszierendem Protein-Marker an ihrer Carboxyltermini hergestellt, die für den direkten Nachweis der rekombinanten Proteine ​​ermöglicht. Die Doppel-Transfektion von Zellen mit Plasmiden Konstrukten für die Gene von Interesse und einem bekannten subzellulären Marker ermöglicht lebende Zellen und eine verbesserte Validierung von zellulären Proteinlokalisierung beherbergen.

Introduction

Die Herstellung von rekombinanten Proteinen Insektenzellexpressionssysteme bietet zahlreiche Vorteile für die Untersuchung von eukaryotischen Proteinen. Und zwar besitzen Insektenzellen ähnliche post-translationale Modifikationen, die Verarbeitung und Sortiermechanismen wie jene , die in Säugetierzellen, die zur Herstellung von korrekt gefalteten Proteinen ^{1, 2, 3} vorteilhaft sind. Insektenzellsysteme , auch benötigen in der Regel weniger Ressourcen und weniger Zeit und Aufwand für die Wartung als Säugetier-Zelllinien ^{4, 5.} Das Baculovirus-Expressionssystem ist ein solches Insektenzell-basiertes System, das heute weit verbreitet in vielen Disziplinen verwendet wird, einschließlich der Herstellung von rekombinanten Proteinen für die Proteincharakterisierung und Therapeutika, die immunogene Präsentation von Fremdpeptiden und virale Proteine, die für die Impfstoffherstellung, die Synthese von mehr -Protein KomplexeDie Herstellung von glycosylierten Proteinen, etc. ^{1, 2, 4, 6.} Es gibt jedoch Situationen , in denen von Baculovirus – Expressions nicht anwendbar sein , ^{3, 7,} und die Verwendung von nichtlysierende und transienten Insektenexpressionssystemen kann besser geeignet sein. Insbesondere transiente Insektenzellexpressions die Möglichkeit zur schnellen Synthese von rekombinantem Protein bieten, weniger Entwicklung und Wartung erfordert, nicht viralen auferlegte Zelllyse beteiligt, und stellt ein Mittel besseren zellularen Handel während Proteins zu studieren Synthese ^{7, 8, 9, 10.}

Dieses Protokoll beschreibt die schnelle Erzeugung von Expressionsvektoren unter Verwendung von Zweistufen-Überlappungsverlängerungs-PCR (OE-PCR) <sup class = "Xref"> 11 und die Standard – Klonierung von Plasmid – DNA in Escherichia coli. Plasmide sind doppelt transfizieren kommerziell erhältlichen gezüchteten Insektenzellen verwendet und repräsentative Proteine ​​zu produzieren. Das Protokoll beschreibt die Herstellung und Verwendung von zwei verschiedenen fluoreszenzmarkierten subzellulären Markerproteinen und zeigt Kolokalisation mit zwei Aquaporin – Proteinen aus dem Insekten Bemisia tabaci. Das folgende Protokoll stellt die grundlegende Methodik für OE-PCR, Insektenzell Wartung und Transfektion und Fluoreszenzmikroskopie für die zelluläre Lokalisation von Zielproteinen.

Protocol

1. OE-PCR für die Konstruktion von Expressionsplasmiden Hinweis: Siehe Tabelle 1 für alle verwendeten Primer in OE-PCR. Die Verwendung einer High-Fidelity DNA-Polymerase wird für alle Amplifikationen empfohlen. Da jedoch diese Enzyme häufig nicht verlassen, ein 3' A, ist es notwendig, eine kurze, nicht-Amplifizierung Inkubation mit einer Taq-DNA-Polymerase zu ‚A-tail‘ auszuführen, um die PCR-Produkte, bevor sie in einen TA-Insektenzellen-Expressions klonen Vektor….

Representative Results

OE-PCR OE-PCR ermöglicht die Synthese von chimären DNA-Produkten, die, einmal in einen Expressionsvektor eingefügt ist, ermöglichen die Herstellung von rekombinanten chimären Proteinen zu jedem Test Gen von Interesse und fluoreszierenden Markerprotein entsprechen. 1 stellt ein allgemeines Schema für die Herstellung von PIB – Expressionsvektoren , enthaltend B. tabaci Aquaporin – codierenden Sequenz…

Discussion

Heterologe Proteinexpressionssysteme sind wichtige Werkzeuge für die Herstellung von rekombinanten Proteinen in zahlreichen Anwendungen eingesetzt Downstream ^4. Die Auswahl aus den verschiedenen Expressionssystemen zur Verfügung, hängt vom Endziel für das Protein von Interesse. Mehr Insektenzellexpressionssysteme zur Verfügung , die flexible Alternativen zu pro- und eukaryotischen Zellexpressionssystemen ^{5, 6} bieten. Insektensysteme …

Materials

KOD DNA Polymerase	EMD Millipore	71085-3	High-fidelity DNA polymerase used for PCR amplification of overlap extension PCR products
ExTaq DNA Polymerase	TaKaRa-Clontech	RR001B	DNA polymerase used for A-tailing of PCR products
EconoTaq PLUS GREEN 2x DNA Polymerase Master Mix	Lucigen	30033-1	DNA polymerase used for bacterial colony PCR
Biometra TProfessional Gradient Thermocycler	Biometra/LABRepCo	070-851
Agarose LE	Benchmark Scientific	A1705
SYBR Safe DNA Gel Stain	ThermoFisher	S33102
Montage DNA Gel Extraction Kit	EMD Millipore	LSKGEL050
pIB/V5-His TOPO TA Expression Kit	ThermoFisher	K89020	Contains components needed to clone overlap extension PCR products, including linearized and topoisomerase I-activated pIB/V5-His-TOPO vector, One Shot TOP10 chemically competent E. coli, and salt solution.
QIAprep Spin MiniPrep Kit	Qiagen	27104
QIAcube Robotic Workstation	Qiagen	9001292
Purifier Vertical Clean Bench	Labconco	3970401
Tni cultured insect cell Line	Allele Biotech	ABP-CEL-10005
Sf9 cultured insect cell Line	Allele Biotech	ABP-CEL-10002
Serum-Free Insect Culture Medium	Allele Biotech	ABP-MED-10002
TNM-FH Insect Culture Medium	Allele Biotech	ABP-MED-10001
IPL-41 Insect Medium	ThermoFisher	11405081
Cellfectin II Transfection Reagent	ThermoFisher	10362100
16 cm Disposable Cell Scrapers	Sarstedt	83.1832	Cell scrapers with two-position blade
25 cm2 (T25) Tissue Culture Flasks with Vent Filter Caps	Life Science Products	CT-229331
Transfer Pipets	Fisher	1371120
Sterile, 50 mL Bio-Reaction Tubes	Life Science Products	CT-229475
PipetteBoy	VWR	14222-180
5 mL Serological Pipettes	Sarstedt	86.1253.001
0.5 mL Flat-Cap PCR Tubes	Fisher	14230200
Polypropylene Biohazard Autoclave Bags	Fisher	01828C
35 mm #1.5 Glass Bottom Dishes	Matsunami Glass	D35-14-1.5-U	35 mm dish diameter, 14 mm glass diameter, 1.5 mm glass thickness, uncoated
Incubator, Model 1510E	VWR	35823-961
Countess II FL Cell Counter	ThermoFisher	AMQAF1000
Countess Cell Counting Chamber Slides with 0.4% Trypan Blue Reagent	ThermoFisher	C10228
Fluoview FV10i-LIV Laser Scanning Confocal Microscope	Olympus	FV10i-LIV
HsPLA2/pCS6 plasmid DNA	transOMIC Technologies	TCH1303
pmCherry Vector	Clontech	632522
NucBlue Live ReadyProbes Reagent (Hoechst 33342)	ThermoFisher	R37605