क्रायोजेनिक तापमान पर एक्शस चश्मा की घनत्व को मापना
Summary
कांच के चरण घनत्व को निर्धारित करने के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन है- पीको-लीटर का आकार क्रायोजेनिक तापमान पर जलीय मिश्रणों की बूंदों से होता है।
Abstract
हम जलीय मिश्रणों के कांच का चरण क्रायोजेनिक तापमान घनत्व, और अन्य नमूनों का निर्धारण करने के लिए एक विधि का प्रदर्शन करते हैं जो वांछित क्रायोजेनिक तापमान चरण तैयार करने के लिए तेजी से कूलिंग की आवश्यकता होती है। पिक्लिकर आकार की सूजन के लिए माइक्रोलाइटर एक तरल नाइट्रोजन-आर्गन (एन 2- एआर) मिश्रण में प्रक्षेपण से ठंडा हो जाता है। ड्रॉप के क्रायोजेनिक तापमान चरण एक्स-रे विवर्तन माप के साथ सहसंबंधित एक दृश्य परख का उपयोग करके मूल्यांकन किया जाता है। तरल एन 2 -एर मिश्रण की घनत्व को एन 2 या एआर जोड़कर समायोजित किया जाता है जब तक कि ड्रॉप नपुंसक रूप से प्रसन्न न हो जाए। इस मिश्रण का घनत्व और इस तरह ड्रॉप के एक परीक्षण जन और आर्किमिडीज सिद्धांत का उपयोग करके निर्धारित किया जाता है। ड्रॉप तैयारी में उचित देखभाल के साथ, लिक्विड क्रायोजेन मिश्रण से ऊपर के टुकड़े को कम करने के लिए प्रबंधन, और घनत्व स्तरीकरण और चरण पृथक्करण को रोकने के लिए क्रायोजेनिक मिश्रण का नियमित मिश्रण, <0.5% बूंदों के लिए सटीक, 50 पीएल जितना छोटा हो सकता हैआसानी से निर्धारित किया जाना चाहिए जलीय cryoprotectant मिश्रण पर माप cryoprotectant कार्रवाई में अंतर्दृष्टि प्रदान करते हैं, और जैविक cryopreservation में थर्मल संकुचन मिलान की सुविधा के लिए मात्रात्मक डेटा प्रदान करते हैं।
Introduction
उनके विभिन्न चरणों में पानी और जलीय मिश्रणों के भौतिक गुण मूलभूत हित हैं, और विवो और जैविक प्रणालियों के इन विट्रो समझ में महत्वपूर्ण हैं। समकालीन रोबोटोलॉजी और जैविक क्रायोएपर्सेशन में, जलीय cryoprotectant मिश्रण का कांच या अनाकार चरण विशेष रुचि 1 , 2 के हैं । न्यूक्लेईशन और बर्फ क्रिस्टल की वृद्धि कोशिकाओं और ऊतकों को बाधित कर सकती है, और प्रोटीन विकार और एकत्रीकरण को बढ़ावा दे सकती है, इसलिए क्रोनोकेशेशेशन प्रोटोकॉल जो विलायक काटते हैं, वे तेजी से लोकप्रिय हो गए हैं बायोमोलेक्युलर क्रिस्टलोग्राफी में, बायोमोलेक्लस के बीच के चैनलों में विलायक का क्रिस्टलीकरण क्रिस्टल लैटेस को विघटित करता है और विवर्तन गुणों को घटाता है। ग्लिसरॉल, एथिलीन ग्लाइकॉल, पॉलीथिलीन ग्लाइकोल (पीईजीएस) जैसे क्रिप्ट्रोक्टेक्टीक विलायकों के तेजी से ठंडा, निर्जलीकरण और जोड़ के विट्रिफिकेशन को प्राप्त किया जाता है,अल्कोहल, और लवण
विट्रीफिकेशन बर्फ क्रिस्टलीकरण और विकास को सीमित करता है, लेकिन सभी ठंडा-संबंधित नमूना क्षति को खत्म नहीं करता है। उदाहरण के लिए, क्रिस्टल मोसाइसिटी (क्रिस्टल प्लेन ओरिएंटेशन के वितरण का एक उपाय) नियमित रूप से 10 से 100 के एक कारक से बढ़ जाता है, जब प्रोटीन क्रिस्टल एक वर्ट्रिफाइड राज्य 3 में ठंडा हो जाते हैं, और वर्ट्रिफाइड शुक्राणु कोशिकाओं और ओक्साइट्स के बाद के पिघलना अस्तित्व दर व्यापक रूप से भिन्न होते हैं ।
एक क्षति तंत्र 3 , 4 , 5 को ठंडा करने के दौरान विलायक और आस-पास की सामग्री के अंतर के संकुचन है। एक क्रिस्टल, कोशिका या ऊतक के भीतर संतुलन विलायक और घुलनशील सांद्रता तापमान पर निर्भर होती है, और विलायक प्लस से घुलनशील और आस-पास की सामग्री विभिन्न मात्राओं से अनुबंधित हो सकती है। रैपिड कूलिंग से विलायक और विलायक पुनर्वितरण को विच्छेद करने से पहले, और विभेदक संविदा को रोक सकता है पर बड़े, अघोषित हो सकता है, कोई भी नहीं है कि नमूना क्षति का कारण बनता है।
ठंडा-प्रेरित क्षति को कम करने के लिए तर्कसंगत दृष्टिकोण इस प्रकार तरल और vitrified जलीय मिश्रण की तापमान-निर्भर घनत्व के ज्ञान से लाभ उठा सकता है। समाधान (वजन / डब्ल्यू) के वजन के लिए 50% से अधिक घनत्व पर सॉल्यूस सांद्रता पर, अधिकांश जलीय क्रियोप्रोटेक्टेंट मिश्रण को 10 के / या उससे कम की मामूली शीतलन दर से काट दिया जा सकता है, जिससे बड़े कांच के नमूनों का उपयोग करके उत्पादन और घनत्व माप की अनुमति मिलती है। नाइट्रोजन जैसे तरल क्रायोजेन में निलंबित होने पर नमूने के स्पष्ट भार को मापकर घनत्व को आर्किमिडीज़ के सिद्धांत का उपयोग करके निर्धारित किया जा सकता है। हालांकि, चूल्हे की एकाग्रता घट जाती है, व्रितकरण में तेजी से बढ़ने के लिए आवश्यक शीतलन दर तेजी से बढ़ जाती है: जलीय ग्लिसरॉल मिश्रण के लिए शीतलक दरें <10 के / एस से बढ़ जाती है, जी में घुलनतन का 50% भार एमएल (डब्ल्यू / वी) में> 1,000> के / एस में 25% w / vAss = "xref"> 7 हीट ट्रांसफर सीमा-परत सीमित हो जाता है, जिससे बड़े शीतलन दर को प्राप्त करने के लिए छोटे और छोटे नमूने 8 की आवश्यकता होती है।
शुद्ध-कांच के पानी और बर्फ की घनत्व का माप एक सूक्ष्म-ठंडा सतह पर एक वैक्यूम में सूक्ष्म-व्यास-व्यास (फेटेटोलिटर वॉल्यूम) जमा करके प्राप्त किया गया है ताकि एक मैक्रोस्कोपिक (ग्राम द्रव्यमान) नमूना तैयार किया जा सके। इस नमूने का घनत्व एक तरल नाइट्रोजन-आर्गन मिश्रण में cryoflotation द्वारा निर्धारित किया गया था, जिसमें क्रायोजेनिक तरल का घनत्व समायोजित किया गया था जब तक नमूना neutrally 9 प्रसन्नता नहीं हो। हालांकि, बड़ी संख्या में छोटे बूंदों से बड़े पैमाने पर उत्पन्न होने वाले तरीके से शून्य मात्रा को कम करता है – पिछले कांच का घनत्व माप में त्रुटि का एक महत्वपूर्ण स्रोत – गैर तुच्छ है जलीय मिश्रण के लिए, वैक्यूम में एयरोसोलिज़न और बयान के दौरान समाधान घटकों के अंतर वाष्पीकरण को जन्म दे सकता हैजमा सांद्रता में पर्याप्त अनिश्चितताएं
हमने एक विधि विकसित की है, जो कि cryoflotation के आधार पर है, जो व्यक्तिगत घोल के उपयोग से जलीय मिश्रण के सटीक घनत्व निर्धारण को छोटे रूप में 50 पीएल 10 की अनुमति देता है । इन बूँदें तेजी से अपने मूल सांद्रता को बनाए रखने के दौरान ठंडा हो सकती हैं, और उनके क्रायोजेनिक तापमान राज्य (vitrified या क्रिस्टलीय) एक्स-रे विवर्तन माप के साथ संबंध है कि एक सरल दृश्य परख का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है। यह विधि मोटे तौर पर जलीय और गैर-जलीय मिश्र धातुओं पर लागू होती है, और कोशिकाओं ( जैसे , स्टेम और अंडे), ऊतक के नमूनों और प्रोटीन क्रिस्टल सहित कई जैविक नमूनों में विस्तारित किया जा सकता है जो 0.8 और 1.4 ग्राम / एमएल।
Protocol
Representative Results
Discussion
वर्तमान उपकरण और विधियां, मुख्य रूप से अंडरग्रेजुएट्स द्वारा उपकरण-निर्माण उपकरण और मशीनरी तक सीमित पहुंच के साथ विकसित की जाती हैं, फिर भी 50 पीएल के रूप में छोटे के रूप में व्यक्तिगत तरल बूंदों के लिए ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम एनएसएफ द्वारा पुरस्कार के तहत समर्थित था MCB-1330685 डीडब्ल्यूएम कॉर्नेल विश्वविद्यालय के आणविक बायोफिज़िक्स ट्रेनिंग ग्रांट (एनआईएच टी 32 जीएम 20082567) से आंशिक समर्थन को स्वीकार करता है।
Materials
| centrifuge tube | Falcon | 6029236 | 15 mL conical centrifuge tube |
| glycerol, >99.5% | Sigma | G9012-100 mL | |
| ethylene glycol, >99.8% | Sigma | 324558-100 mL | |
| analytical microbalance | Mettler | AE240 | Analytical balance, 0.01 mg resolution, has hook on bottom for weighing below the balance |
| vortexer | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex-Genie 2 |
| Apparatus enclosure framing | Unistrut | 1-5/8" metal framing | 48" wide x 24" deep x 40" tall |
| Apparatus enclosure air barrier | any clear plastic sheeting | ||
| neoprene rubber disk | 4" diameter, 1/8" thick | ||
| dewar flask | Scilogix Dilvac | SS333 | 4.5 liter dewar flask with steel case and clamp lid |
| copper chamber | This fabricated part is comprised of a 1.43" diameter, 0.017" wall thickness copper tube with a solid cylindrical copper base soldered to seal one end. The copper base is 0.87" tall and the overall chamber height is 7". | ||
| nitrogen gas | Airgas | NI HP300 | 99.998% pure N2 gas |
| argon gas | Airgas | AR HP300 | 99.998% pure Ar gas |
| rotameter | Omega | FL3692ST | 2.52 l/min max flow rate |
| foam insulating lid | This part is fabricated from 4 lb/ft3 crosslinked polyethylene foam (supplied by Technifab, 1355 Chester Industrial Parkway, Avon, OH), and has an OD of 2.42", and ID of 1.52", and a thickness of 0.79". | ||
| PTFE test mass | This fabricated part is a 0.246" diameter, 0.580" tall cylinder with a 0.060" diameter hole running perpendicular to and intersecting the cylinder axis ~0.10" from one end. | ||
| microbalance platform | Unistrut | 1-5/8" metal framing | 11" wide x 24" long x 24" high rectangular frame with an top aluminum sheet containing a hole for the monofilament and hanging test mass |
| 2 mil (50 um) monofilament line | Berkley | NF1502-CM | Nanofil fishing line |
| Argon precooling coil tubing | VWR | 60985-512 | 1/8" ID x 1/4" OD PVC tubing |
| perforated copper foil mixer | 1.4" diameter, 35 micron thick copper disk, cut from 1 ounce/ft2 copper sheet and perforated with holes using an awl or other sharp pointed tool. Insert 1-2 mm diameter rigid thermally insulating (plastic or wood) rod into the center and fix using epoxy as needed. | ||
| syringe | BD | 309628 | 1 ml Luer-Lok tip syringe |
| vacuum generator | Gast | VG-015-00-00 | compressed air venturi single stage vacuum generator |
| hydrophobic coating spray | RainX | 620036 | plastic water repellent |
| long focal length stereo microscope | Bausch and Lomb Stereozoom 6 | 0.67-4 x zoom pod with 20x eyepieces, 10 cm working distance | |
| LED ring illuminator | Amscope | LED144S | |
| LED spot illuminator | Newhouse Lighting | NHCLP-LED | 3W LED gooseneck clamp lamp |
| 1.8 ml cryo vial | Nunc | V7634-500EA | Any 1.8 or 2 ml cryovial is adequate |
References
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