극저온에서 수성 유리의 밀도 측정
Summary
극저온에서 수성 혼합물의 마이크로 – 피코 리터 크기의 액 적의 유리 상 밀도를 결정하기위한 프로토콜이 기술되어있다.
Abstract
우리는 원하는 극저온 단계를 준비하기 위해 수성 혼합물 및 빠른 냉각이 필요한 다른 샘플의 유리 상 극저온 밀도를 결정하는 방법을 시연합니다. 마이크로 리터 대 피코 리터 크기의 드롭은 액체 질소 – 아르곤 (N2-Ar) 혼합물 내로 투영함으로써 냉각된다. 방울의 극저온 단계는 X 선 회절 측정과 관련이있는 시각적 분석을 사용하여 평가됩니다. 액체 N 2 -Ar 혼합물의 밀도는 방울이 중성 부력이 될 때까지 N 2 또는 Ar을 첨가하여 조정한다. 이 혼합물의 밀도 및 따라서 낙하의 밀도는 시험 매스 (test mass) 및 아르키메데스 (Archimedes) 원리를 사용하여 결정된다. 방울 준비, 액체 냉각제 혼합물 위의 가스 관리로 빙결을 최소화하고 저온 혼합물을 규칙적으로 혼합하여 밀도 층화 및 상분리를 방지하고 밀도가 50pL만큼 작은 방울의 <0.5 %까지 정확합니다쉽게 결정될 수있다. 수성 동결 방지제 혼합물에 대한 측정은 동결 방지제 작용에 대한 통찰력을 제공하고, 생물학적 동결 보존에서의 열 수축 정합을 용이하게하는 정량적 데이터를 제공한다.
Introduction
다양한 단계에서 물과 수성 혼합물의 물리적 성질은 근본적인 관심사이며 생체 내 및 생체 외 시스템의 생체 시스템 이해에 중요합니다. 현재의 저온 생물학 및 생물학적 저온 보존에서, 수성 저온 보호제 혼합물의 유리질 또는 비결 정성 단계는 특히 중요하다. 핵 결정의 핵 형성과 성장은 세포와 조직을 파괴하고 단백질의 변성과 응집을 촉진시켜 용제를 투명하게하는 저온 보존 프로토콜이 점점 대중화되고 있습니다. 생체 분자 결정학에서 생체 분자 사이의 채널에서 용매의 결정화는 결정 격자를 파괴하고 회절 특성을 저하시킵니다. 유리질 제거 (Vitrification)는 급냉, 탈수 및 글리세롤, 에틸렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 (PEG)과 같은 동결 방지용 용질의 첨가를 통해 달성됩니다.알콜 및 염.
유리화는 얼음 결정화 및 성장을 제한하지만 모든 냉각 관련 샘플 손상을 제거하지는 않습니다. 예를 들어, 단백질 결정이 유리화 상태로 냉각 될 때 결정 모세관 현상 (결정 평면 방향 분포의 척도)은 일반적으로 10 내지 100 배 증가하고, 유리화 된 정자 세포 및 난 모세포의 해동 후 생존율은 광범위하게 변한다 .
하나의 손상 메커니즘은 냉각 과정에서 용매 및 주변 물질의 수축 차이 3 , 4 , 5 입니다. 결정, 세포 또는 조직 내의 평형 용매 및 용질 농도는 온도에 의존하고, 용제 + 용질 및 주변 물질은 상이한 양만큼 수축 될 수있다. 급속 냉각은 유리화 및 용융 계약 이전에 용매 및 용질 재분배를 방지 할 수 있습니다. 시료가 손상 될 수있는 크고 불균일 한 비 평형 응력을 유발할 수 있습니다.
따라서 냉각에 의한 손상을 줄이기위한 합리적 접근법은 액체 및 유리질을 함유 한 수성 혼합물의 온도 의존 밀도에 대한 지식으로부터 이익을 얻을 수있다. 용질의 중량 대비 50 % 이상의 용질 농도 (w / w)에서 대부분의 수성 동결 방지제 혼합물은 10 K / s 이하의 적당한 냉각 속도로 유리화되어 큰 유리질 시료를 사용하여 밀도 측정 및 생산이 가능합니다. 밀도는 질소와 같은 액체 한제에 현탁 될 때 시료의 겉보기 무게를 측정하여 아르키메데스의 원리를 사용하여 결정할 수 있습니다. 그러나 용질 농도가 감소함에 따라 유리화에 필요한 냉각 속도가 빠르게 증가합니다. 수용성 글리세롤 혼합물의 냉각 속도는 g의 용질 50 % 중량에서 10K / s에서 mL (w / v)의 용적에서 1,000 25 % w / v의 K / sass = "xref"> 7. 열전달은 경계층이 제한되어보다 큰 냉각 속도를 달성하기 위해서는 더 작고 작은 샘플이 필요합니다.
순수 유리질 물 및 얼음의 밀도 측정은 거시적 인 (그램 덩어리) 샘플을 형성하기 위해 극저온 냉각 된 표면 상에 마이크로 미터 직경 (펨토 리터 부피)의 드롭을 진공으로 증착시킴으로써 달성되었다. 이 샘플의 밀도는 액체 질소 – 아르곤 혼합물에서 극저온 액체의 밀도가 샘플이 중성으로 부양 될 때까지 조정 된 극저온 냉각 (cryoflotation)에 의해 결정되었다. 그러나 이전의 유리질 밀도 측정에서 중요한 오류 원인 인 공극 체적을 최소화하는 방식으로 많은 수의 작은 방울에서 큰 샘플을 생성하는 것은 그리 중요하지 않습니다. 수성 혼합물의 경우 에어로졸 화 및 진공 증착시 용액 성분의 차등 증발은침착 된 농도의 실질적인 불확실성.
우리는 cryoflotation에 기초한 방법을 개발하여 개별 방울 50 pL 10을 사용하는 수성 혼합물의 정확한 밀도 결정을 가능하게했습니다. 이 방울은 원래 농도를 유지하면서 빠르게 냉각 될 수 있으며, 극저온 상태 (유리화 또는 결정질)는 X- 선 회절 측정과 상관 관계가있는 간단한 시각적 분석을 사용하여 평가할 수 있습니다. 이 방법은 수성 및 비 수성 혼합물에 광범위하게 적용 할 수 있으며 세포 ( 예 : 줄기와 난), 조직 표본 및 단백질 밀도가 0.8 ~ 1.4 g / mL이다.
Protocol
Representative Results
Discussion
그럼에도 불구하고 장비 제작 도구 및 기계류에 대한 접근이 제한적인 학부생에 의해 주로 개발 된 본 장치 및 방법은 50pL만큼 작은 개별 액체 방울에 대해 매우 정확한 밀도 측정을 제공합니다. 유리화 된 시료를 얻기에 작은 냉각 속도가 충분한 50 % w / w 이상의 농도 범위에서 벌크 시료에 대한 이전의 측정에서 얻은 밀도와 일치합니다. 현재 밀도가 0 % 농도 – 순수한 것으로 외삽 된 것은 또한 77K…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 MCB-1330685 상을 수상한 NSF의 지원을 받았다. DWM은 Cornell University의 분자 생물 물리학 훈련 보조금 (NIH T32GM0082567)의 부분 지원을 인정합니다.
Materials
| centrifuge tube | Falcon | 6029236 | 15 mL conical centrifuge tube |
| glycerol, >99.5% | Sigma | G9012-100 mL | |
| ethylene glycol, >99.8% | Sigma | 324558-100 mL | |
| analytical microbalance | Mettler | AE240 | Analytical balance, 0.01 mg resolution, has hook on bottom for weighing below the balance |
| vortexer | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex-Genie 2 |
| Apparatus enclosure framing | Unistrut | 1-5/8" metal framing | 48" wide x 24" deep x 40" tall |
| Apparatus enclosure air barrier | any clear plastic sheeting | ||
| neoprene rubber disk | 4" diameter, 1/8" thick | ||
| dewar flask | Scilogix Dilvac | SS333 | 4.5 liter dewar flask with steel case and clamp lid |
| copper chamber | This fabricated part is comprised of a 1.43" diameter, 0.017" wall thickness copper tube with a solid cylindrical copper base soldered to seal one end. The copper base is 0.87" tall and the overall chamber height is 7". | ||
| nitrogen gas | Airgas | NI HP300 | 99.998% pure N2 gas |
| argon gas | Airgas | AR HP300 | 99.998% pure Ar gas |
| rotameter | Omega | FL3692ST | 2.52 l/min max flow rate |
| foam insulating lid | This part is fabricated from 4 lb/ft3 crosslinked polyethylene foam (supplied by Technifab, 1355 Chester Industrial Parkway, Avon, OH), and has an OD of 2.42", and ID of 1.52", and a thickness of 0.79". | ||
| PTFE test mass | This fabricated part is a 0.246" diameter, 0.580" tall cylinder with a 0.060" diameter hole running perpendicular to and intersecting the cylinder axis ~0.10" from one end. | ||
| microbalance platform | Unistrut | 1-5/8" metal framing | 11" wide x 24" long x 24" high rectangular frame with an top aluminum sheet containing a hole for the monofilament and hanging test mass |
| 2 mil (50 um) monofilament line | Berkley | NF1502-CM | Nanofil fishing line |
| Argon precooling coil tubing | VWR | 60985-512 | 1/8" ID x 1/4" OD PVC tubing |
| perforated copper foil mixer | 1.4" diameter, 35 micron thick copper disk, cut from 1 ounce/ft2 copper sheet and perforated with holes using an awl or other sharp pointed tool. Insert 1-2 mm diameter rigid thermally insulating (plastic or wood) rod into the center and fix using epoxy as needed. | ||
| syringe | BD | 309628 | 1 ml Luer-Lok tip syringe |
| vacuum generator | Gast | VG-015-00-00 | compressed air venturi single stage vacuum generator |
| hydrophobic coating spray | RainX | 620036 | plastic water repellent |
| long focal length stereo microscope | Bausch and Lomb Stereozoom 6 | 0.67-4 x zoom pod with 20x eyepieces, 10 cm working distance | |
| LED ring illuminator | Amscope | LED144S | |
| LED spot illuminator | Newhouse Lighting | NHCLP-LED | 3W LED gooseneck clamp lamp |
| 1.8 ml cryo vial | Nunc | V7634-500EA | Any 1.8 or 2 ml cryovial is adequate |
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