Et integrert System eksternt utløse intracellulær signaltransduksjon av Upconversion Nanoparticle-mediert Kinase Photoactivation
Summary
I denne protokollen, bur protein kinase A (PKA), en cellular signal signaltransduksjon bioeffector, var immobilisert på hydrogenion underlag, microinjected i stoffer og aktivert ved upconverted UV lys fra nær infrarød (NIR) bestråling, inducing nedstrøms stress fiber oppløsningen i stoffer.
Abstract
Upconversion hydrogenion (UCNP)-mediert photoactivation er en ny tilnærming til eksternt kontroll bioeffectors med mye mindre Phototoksisitet og dypere vev gjennomtrenging. Men er eksisterende instrumentering på markedet ikke lett kompatibel med upconversion program. Derfor er endrer kommersielt tilgjengelige instrumentet viktig for denne forskningen. I dette papiret illustrere vi først endringene konvensjonelle fluorimeter og fluorescens mikroskop for å gjøre dem kompatible for Foton upconversion eksperimenter. Vi beskriver syntesen av en nær infrarød (NIR)-utløst bur protein kinase A katalytisk delenhet (PKA) immobilisert på et UCNP kompleks. Parametere for microinjection og NIR photoactivation prosedyrer rapporteres også. Etter den bur PKA-UCNP er microinjected i REF52 fibroblast celler, utløser NIR bestråling, som er betydelig bedre enn konvensjonelle UV bestråling, effektivt PKA signal signaltransduksjon veien i levende celler. I tillegg bekrefter positive og negative kontroll eksperimenter at PKA-indusert veien fører til oppløsningen av stress fiber er spesielt utløst av NIR bestråling. Dermed gir bruk av protein-endret UCNP en innovativ tilnærming for å fjernstyre lys-modulert mobilnettet eksperimenter, som direkte eksponering for UV lys må unngås.
Introduction
Kjemisk endret proteiner som kan photoactivated (f.eks PKA bur proteiner) har blitt utviklet som et nye felt i kjemisk biologi ikke-invasively manipulere intercellulære biokjemiske prosesser1,2 ,3. Ved hjelp av lys som en stimulans gir god spatiotemporal oppløsning når du aktiverer disse bur proteiner. UV lys kan imidlertid forårsake uønskede morfologiske endringer, apoptose og DNA skade celler4,5. Derfor, den siste utviklingen i utformingen av photocaging grupper fokus på aktivere photocleavage ved lengre-bølgelengde eller to-fotonet eksitasjon å redusere Phototoksisitet, så vel som for å øke dype vev penetrasjon6,7. Caging grupper som svarer til lengre bølgelengde tillater oss å velge passende uncaging bølgelengder (i.e.kanaler) å selektivt aktivere bioeffectors når to eller flere caging grupper er tilstede7. Gitt disse nyttige funksjoner, er utvikle nye røde lys photocaging grupper svært viktig oppstrøms arbeid i fotokjemisk metoder for biologiske studier fra undersøkelser mekanismer av reaksjoner å kontrollere mobilnettet aktiviteter8. Likevel, en to-fotonet caging gruppe er normalt for hydrofobe på grunn smeltet aromatiske ringen, og en synlig lys caging gruppe er normalt organometalliske, med aromatiske ligander. Hydrofobe/aromatiske egenskapen passer ikke når bioeffector er et protein eller enzym, som det denatures webområdet aktivering av enzym/protein og forårsaker tap av funksjon, selv om den bøyning og photolysis fortsatt fungerer på kjemiske nivå2 ,9.
UCNPs er effektive transdusere som konvertere NIR eksitasjon lyset til UV. Dette unike og spennende eiendom UCNPs har tilbudt realistisk løsninger på utfordringene knyttet til photoactivation og utløste kontrollert utgivelsen av små molekyler, inkludert folsyre10, cisplatin derivater11 , DNA/siRNA12copolymer blemmer13og hul partikler14. Imidlertid etter beste overbevisning, har UCNP-assistert photoactivation av enzymer og proteiner ikke blitt testet så langt. Fordi det ikke er noe vellykket tilfelle av bruker rødt lys eller NIR å fotoaktive et enzym, vi ble bedt om å utføre NIR-utløst aktivering av en protein/enzym konstruere består av kjemisk endret bur enzym komplekser med en silica-belagt, transisjonsmetall-dopet UCNP15. UCNP var konjugert med et raskt reagere signal signaltransduksjon kinase i form av bur PKA i denne studien. PKA styrer glykogensyntese og cellen cytoskjelett regulering som reagerer på eksterne stimuli via syklisk adenosin fosfat (cAMP) regulering i stoffer16. Vi studerte muligheten for enzym aktivisering i timelige og romlig oppførsel i en mobilnettet eksperiment etter NIR bestråling. Denne UCNP-assistert photoactivation-plattformen er en ny metode for å photoactivate et enzym bruker NIR, og unngår uønskede signal signaltransduksjon svaret fra celler forårsaket av konvensjonelle UV bestråling2,4.
Det er svært vanskelig å translocate store bioeffectors (f.eks proteiner) over cellemembranen kontrollere cellular aktivitet. Selv om partikkel-immobilisert protein kan være lettere å translocate via endocytose i stoffer, kan endocytose være skadet eller degradert via endosomal entrapment og påfølgende lysosomale fornedrelse2,4. Selv om bur protein er fremdeles funksjonell etter membran translokasjon, kan translocated beløpene ikke være nok til å utløse cellulær respons2,17. I skarp kontrast er microinjection en direkte og kvantitativ tilnærming til å levere store bioeffectors til cytoplasma i cellen. Videre krever UCNP-immobilisert bioeffector upconverted lys skal aktiveres. Derfor krever optisk instrumentering ytterligere endring måle, visualisere og utnytte upconversion lyset. I dette arbeidet beskrives levering av et bur PKA-UCNP kompleks til en celle med microinjection og følgende viktige spektroskopi og mikroskopi endringer for NIR photoactivation i detalj.
Protocol
Representative Results
Discussion
Tidligere fant Hofmann og kolleger at dramatiske morfologiske endringer ble observert i REF52 celler etter microinjection av gratis PKA19. I en annen studie demonstrerte Lawrence gruppen at bur PKA kan være aktivert i vivo, fører til morfologiske endringer og oppløsningen av stress fiber når de utsettes for UV photolysis20. Tidligere rapporter om utnytte upconverted UV lys for photoactivation viste aktivering av flere UCNP-assistert, bur, små molekylære bioef…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Nano vitenskap og teknologi Program av Academia Sinica og departementet for vitenskap og teknologi av Taiwan for finansiering (101-2113-M-001-001-MY2; 103-2113-M-001-028-MY2).
Materials
| Reagent | |||
| Tris(hydorxymethyl)aminomethane | Sigma | 154563 | |
| Magnesium chloride hexahydrate | Sigma | M9272 | |
| MOPS | Sigma | M1254 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| Sodium chloride | Sigma | 31434 | |
| Potassium chloride | Sigma | 12636 | |
| Yttrium acetate hydrate | Sigma | 326046 | Y(C2H3CO2)3 · xH2O |
| Thulium(III) acetate hydrate | Alfa Aesar | 14582 | Tm(CH3CO2)3 · xH2O |
| Ytterbium(III) acetate tetrahydrate | Sigma | 326011 | Yb(C2H3O2)3 · 4H2O |
| 1-Octadecene | Sigma | O806 | |
| Oleic acid | Sigma | 364525 | |
| Methanol | macron | 304168 | |
| Sodium hydroxide | Sigma | 30620 | |
| Ammonium fluoride | J.T.Baker | 69804 | |
| IGEPAL CO-520 | Sigma | 238643 | |
| Cyclohexane | J.T.Baker | 920601 | |
| Amomonium hydroxide (28%-30%) | J.T.Baker | 972101 | Ammonia |
| Tetraethyl orthosilicate (TEOS) | Sigma | 8658 | |
| DL-Dithiothreitol (DTT) | Sigma | D0632 | |
| N-hydroxymaleimide (NHM) | Sigma | 226351 | PKA activity blocking reagent |
| Prionex protein stabilizer solution from hog collagen | Sigma | 81662 | Protein stabilizer solution |
| 2-nitrobenzyl bromide (NBB) | Sigma | 107794 | PKA caging reagent |
| 8-(4-Chlorophenylthio)adenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma | C3912 | 8-CPT-cAMP |
| Pyruvate Kinase/Lactic Dehydrogenase enzymes from rabbit muscle | Sigma | P0294 | PK/LDH |
| Adenosine 5'-triphosphate disodium | Sigma | A2387 | ATP |
| β-NADH reduced from dipotassium | Sigma | N4505 | |
| Phosphoenolpyruvate | Sigma | P7127 | PEP |
| Coomassie Protein Assay Reagent, 950 ml | Thermo Scientific | 23200 | Bradford assay reagent |
| cAMP-dependent protein kinase | Promega | V5161 | PKA activity control |
| pET15b-PKACAT plasmid | Addgene | #14921 | |
| pKaede-MC1 plasmid | CoralHue | AM-V0012 | |
| Phosphate buffered saline (PBS), pH 7.4 | Thermo Scientific | 10010023 | |
| DMEM, high glucose, pyruvate | Gibco | 12800-017 | Cell culture medium |
| Leibovitz L-15 Medium | Biological Industries | 01-115-1A | Cell culture medium |
| Fetal Bovine Serum | Biological Industries | 04-001-1A | |
| Paraformaldehyde | ACROS | 416785000 | |
| DAPI | Invitrogen | D1306 | Nucleus staining dye |
| Alexa 594-phalloidin | Invitrogen | A12381 | F-actin staining dye |
| 5(6)-Carboxyfluorescein | Novabiochem | 8.51082.0005 | |
| 5(6)-Carboxytetramethylrhodamine | Novabiochem | 8.51030.9999 | |
| Pierce Coomassie (Bradford) Protein Assay Kit | Thermo Scientific | 23200 | |
| CelluSep T4 Tubings/Nominal filter rating MWCO 12000-14000 Da | Membrane Filtration Products, Inc. | 1430-33 | Dialysis membrane |
| Millex-HV Syringe Filter Unit, 0.45 µm, PVDF, 13 mm, gamma sterilized | EMD Milipore | SLHVX13NL | |
| Equipment | |||
| Dynamic Light Scattering/Zetapotential Zetasizer nano-ZS | Malvern | M104 | |
| Transmission Electron Microscope | JEOL | JEM-1400 | |
| Fluorescence Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10075200 | Cary Eclipse |
| UV-Vis Spectrophotometer | Agilent Technologies | 10068900 | Cary 50 |
| Fluorescence Microscopy | Olympus | IX-71 | |
| 950 nm longpass filter | Thorlabs | FEL0950 | |
| 850 nm dichroic mirror shortpass | Chroma | NC265609 | |
| RT3 color CCD system | SPOT | RT2520 | |
| Fluorescence Illumination | PRIOR | Lumen 200 | |
| 980nm Infra-red diode laser | CNI | MDL-N-980-8W | |
| UV LED Spot Light Source | UVATA | UVATA-UPS412 | With a UPH-056-365 nm LED at 200 mW/cm2 |
| Thermal pile sensor | OPHIR | 12A-V1-ROHS | |
| Picospritzer III | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Intracellular Microinjection Dispense Systems |
| PC-10 Needle puller | Narishige | PC-10 | |
| MANOMETER Digital pressure gauge | Lutron | PM-9100 | |
| One-axis Oil Hydraulic Micromanipulator | Narishige | MMO-220A | |
| Heraeus Fresco 17 Centrifuge, Refrigerated | Thermo Scientific | 75002421 |
References
- Brieke, C., Rohrbach, F., Gottschalk, A., Mayer, G., Heckel, A. Light-Controlled Tools. Angew Chem Int Ed. 51 (34), 8446-8476 (2012).
- Lee, H. M., Larson, D. R., Lawrence, D. S. Illuminating the Chemistry of Life: Design, Synthesis, and Applications of “Caged” and Related Photoresponsive Compounds. ACS Chem Biol. 4 (6), 409-427 (2009).
- Pavlovic, I., et al. Cellular Delivery and Photochemical Release of a Caged Inositol-pyrophosphate Induces PH-domain Translocation in Cellulo. Nature Commun. 7, 10622-10629 (2016).
- Priestman, M. A., Sun, L. A., Lawrence, D. S. Dual Wavelength Photoactivation of cAMP- and cGMP-Dependent Protein Kinase Signaling Pathways. ACS Chem Biol. 6 (4), 377-384 (2011).
- Amatrudo, J. M., Olson, J. P., Lur, G., Chiu, C. Q., Higley, M. J., Ellis-Davies, G. C. R. Wavelength-Selective One- and Two-Photon Uncaging of GABA. ACS Chem Neurosci. 5 (1), 64-70 (2014).
- Warther, D., et al. Two-Photon Uncaging: New Prospects in Neuroscience and Cellular Biology. Bioorg Med Chem. 18 (22), 7753-7758 (2010).
- Priestman, M. A., Shell, T. A., Sun, L., Lee, H. M., Lawrence, D. S. Merging of Confocal and Caging Technologies: Selective Three-Color Communication with Profluorescent Reporters. Angew Chem. Int Ed. 51 (31), 7684-7687 (2012).
- Hansen, M. J., Velema, W. A., Lerch, M. M., Szymanski, W., Feringa, B. L. Wavelength-selective cleavage of photoprotecting groups: strategies and applications in dynamic systems. Chem Soc Rev. 44 (11), 3358-3377 (2015).
- Klán, P., et al. Photoremovable Protecting Groups in Chemistry and Biology: Reaction Mechanisms and Efficacy. Chem Rev. 113 (1), 119-191 (2013).
- Chien, Y. H., et al. Near-Infrared Light Photocontrolled Targeting, Bioimaging, and Chemotherapy with Caged Upconversion Nanoparticles in Vitro and in Vivo. ACS Nano. 7 (10), 8516-8528 (2013).
- Min, Y. Z., Li, J. M., Liu, F., Yeow, E. K. L., Xing, B. G. Near-Infrared Light-Mediated Photoactivation of a Platinum Antitumor Prodrug and Simultaneous Cellular Apoptosis Imaging by Upconversion-Luminescent Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 53 (4), 1012-1016 (2014).
- Yang, Y. M., Liu, F., Liu, X. G., Xing, B. G. NIR Light Controlled Photorelease of siRNA and Its Targeted Intracellular Delivery Based on Upconversion Nanoparticles. Nanoscale. 5 (1), 231-238 (2013).
- Wu, T. Q., Barker, M., Arafeh, K. M., Boyer, J. C., Carling, C. J., Branda, N. R. A UV-Blocking Polymer Shell Prevents One-Photon Photoreactions while Allowing Multi-Photon Processes in Encapsulated Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 52 (42), 11106-11109 (2013).
- Zhou, L., Chen, Z. W., Dong, K., Yin, M. L., Ren, J. S., Qu, X. G. DNA-mediated Construction of Hollow Upconversion Nanoparticles for Protein Harvesting and Near-Infrared Light Triggered Release. Adv Mater. 26 (15), 2424-2430 (2014).
- Gao, H. -. D., et al. Construction of a Near-Infrared-Activatable Enzyme Platform To Remotely Trigger Intracellular Signal Transduction Using an Upconversion Nanoparticle. ACS Nano. 9 (7), 7041-7051 (2015).
- Wehbi, V. L., Taskén, K. Molecular Mechanisms for cAMP-Mediated Immunoregulation in T cells – Role of Anchored Protein Kinase A Signaling Units. Front Immunol. 7, (2016).
- Pitchiaya, S., Heinicke, L. A., Custer, T. C., Walter, N. G. Single Molecule Fluorescence Approaches Shed Light on Intracellular RNAs. Chem Rev. 114 (6), 3224-3265 (2014).
- Gao, D., Tian, D., Zhang, X., Gao, W. Simultaneous Quasi-one dimensional Propagationand Tuning of Upconversion Luminescence Through Waveguide Effect. Scientific Rep. 6, 22433-22442 (2016).
- Roger, P. P., Rickaert, F., Huez, G., Authelet, M., Hofmann, F., Dumont, J. E. Microinjection of catalytic subunit of cyclic AMP-dependent protein kinases triggers acute morphological changes in thyroid epithelial cells. FEBS Lett. 232 (2), 409-413 (1988).
- Curley, K., Lawrence, D. S. Photoactivation of a Signal Transduction Pathway in Living Cells. J Am Chem Soc. 120 (33), 8573-8574 (1998).
- Carling, C. J., Nourmohammadian, F., Boyer, J. C., Branda, N. R. Remote-control Photorelease of Caged Compounds Using Near-infrared Light and Upconverting Nanoparticles. Angew Chem Int Ed. 49 (22), 3782-3785 (2010).
- Garcia, J. V., et al. NIR-triggered Release of Caged Nitric Oxide Using Upconverting Nanostructured Materials. Small. 8 (24), 3800-3805 (2012).
- Liu, G., Zhou, L. Z., Su, Y., Dong, C. M. An NIR-responsive and sugar-targeted polypeptide composite nanomedicine for intracellular cancer therapy. Chem Commun. 50 (83), 12538-12541 (2014).
