Murine Mammary Gland의 갭, 타이트 및 Adherens 접합부의 구성 요소 사이의 단백질 - 단백질 상호 작용 및 공동 위치 분석
Summary
세포 간 접합은 유선의 단계별 기능과 발달에 필수적입니다. 이 원고는 단백질 – 단백질 상호 작용 (PPIs) 연구를위한 상세한 프로토콜과 쥐 유방 땀샘을 이용한 공동 위치 파악을 제공합니다. 이러한 기술은 서로 다른 발달 단계에서 세포 간 접합 사이의 물리적 연관성의 역 동성을 조사 할 수있게 해줍니다.
Abstract
세포 – 세포 상호 작용은 조직의 보전과 유방의 여러 구획 사이의 장벽을 보존하는 데 중추적 인 역할을합니다. 이러한 상호 작용은 인접 세포간에 넥서스를 형성하는 접합 단백질에 의해 제공됩니다. Junctional protein mislocalization과 결합 파트너와의 물리적 연관성 감소는 기능 상실, 결과적으로 장기 기능 부전을 초래할 수 있습니다. 따라서 정상 및 질병 관련 조직에서 단백질 위치 파악 및 단백질 – 단백질 상호 작용 (PPI)을 확인하는 것은 발달 상태의 질병이나 변화의 진행을 유도하는 새로운 증거와 메커니즘을 찾는 데 필수적입니다. 이 원고는 마우스 유선에서 PPI를 평가하는 2 단계 방법을 제시합니다. 프로토콜 섹션 1에서는 관심있는 단백질에 대해 생성 된 항체와 형광 색소로 표지 된 2 차 항체를 사용하여 동시 면역 형광 (co-immunofluorescence) (co-IF)을 수행하는 방법을 설명합니다. co-IF all단백질의 근접성을 입증해야하기 때문에 신체적 상호 작용을 연구하는 것이 가능합니다. 따라서 co-immunoprecipitation (co-IP)에 대한 자세한 프로토콜은 프로토콜 섹션 2에 나와 있습니다.이 방법은 이러한 상호 작용이 직접적인지 간접적인지를 확인하지 않고 단백질 간의 물리적 상호 작용을 결정하는 데 사용됩니다. 지난 몇 년 동안 co-IF 및 co-IP 기술은 유 전선 발달 동안 변이성 접합부 연결을 생성하면서 세포 간 접합의 특정 구성 요소가 함께 위치하고 상호 작용한다는 것을 입증했습니다.
Introduction
유선의 성장 및 발달은 주로 출생 후 발생합니다. 이 기관은 포유류의 번식을 통해 끊임없이 변모합니다 1 . 성인 유선 선 상피는 내막 상피 세포의 내층과 기저 세포의 외층으로 이루어져 있으며, 주로 상피 세포로 이루어져 있으며 기저막으로 둘러싸여있다. 유선 구조와 발달에 대한 좋은 검토를 위해 독자는 Sternlicht 1 을 참고할 수 있습니다. 글 랜드 1 , 3 , 4 , 5 , 6 의 정상적인 발달과 기능을 위해서는 gap (GJ), tight (TJ), adherens (AJ) junction을 통한 세포 – 세포 상호 작용이 필요합니다. 쥐 유선에서 이들 접합부의 주요 구성 요소는 Cx26, Cx30, Cx32 및 Cx43 (GJ)입니다. 클로 딘 -1, -3, -4, -7 그리고ZO-1 (TJ); 및 E-cadherin, P-cadherin 및 β-catenin (AJ) 7,8 . 이러한 서로 다른 접합 단백질의 발현 수준은 유선 발달 동안 단계에 따라 달라 지므로 차별화 된 세포 – 세포 상호 작용 요구 사항을 제시합니다. GJ, TJ 및 AJ는 구조적 및 기능적으로 연결되어 있고 인접한 세포의 인접한 사이트에 다른 구조적 또는 조절 단백질을 연결하여 교차 결합 관계를 만듭니다. junctional 연결의 구성은 기본 cytoskeleton뿐만 아니라 넥서스 투자율과 안정성과 다리에 영향을 미칠 수 있으며 결과적으로 글 랜드의 기능에 영향을 줄 수 있습니다 8 , 9 , 10 , 11 . 접합부 넥서스에 있거나 서로 다른 곳에서 상호 작용하는 세포 간 접합의 구성 요소최근 유방암 발달 단계를 co-immunofluorescence (co-IF)와 co-immunoprecipitation (co-IP)을 이용하여 분석 하였다. 다른 기술은 단백질 간의 기능적 연관성을 평가할 수 있지만,이 방법은이 원고에 제시되어 있지 않습니다.
단백질은 단지 기능 만 수행하기 때문에 신호 전달 및 생화학 적 계통과 같은 단백질 – 단백질 상호 작용 (PPI)을 연구하는 것은 많은 연구자에게 필수적이며 단백질의 기능에 대한 중요한 정보를 제공 할 수 있습니다. 공동 IF 및 현미경 분석은 동일한 세포 내 공간을 공유하는 몇 가지 단백질을 평가하는 데 도움이됩니다. 그러나 다른 동물에서 키워야하는 항체와 다른 파장의 레이저가 장착 된 공 촛점 현미경 및 멀티플렉싱을위한 스펙트럼 검출기를 사용하여 표적의 수를 제한합니다. Co-IP는 친화적 인 물리적 상호 작용을 확인하거나 공개합니다.단백질 복합체 내에 존재하는 둘 이상의 단백질. 단백질의 위치와 상호 작용을 동시에 감지 할 수있는 형광 공명 에너지 전달 (FRET) 12 및 근접 연결 분석 (PLA) 13 과 같은 새로운 기술의 개발에도 불구하고, co-IP는 적절한 상호 작용을 연구하는 적절한 기술이다 내생 단백질.
이 원고에서 설명한 단계별 방법은 유방 땀샘의 내인성 PPI를 연구 할 때 피하기 위해 단백질 지방화 및 PPI의 연구를 촉진하고 함정을 지적합니다. 이 방법론은 각 기술에 필요한 조직에 대한 다양한 보존 절차를 제시하는 것으로 시작합니다. 1 부는 i) 유방 땀샘의 구분, ii) co-IF 기법을 이용한 여러 단백질의 이중 또는 삼중 표지, iii)단백질 지방화. Part 2는 내인성 단백질을 침전시키고 상호 작용하는 단백질을 i) 용 해물 준비, ii) 간접 단백질 면역 침전 및 iii) SDS-PAGE 및 Western blot에 의한 결합 파트너 식별의 세 단계로 식별하는 방법을 보여줍니다. 이 프로토콜의 각 단계는 설치류 유선 조직에 최적화되어 있으며 고품질의 특이적이고 재현 가능한 결과를 생성합니다. 이 프로토콜은 다른 조직이나 세포주의 PPI 연구의 시작점으로 사용할 수도 있습니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
접합부를 통한 세포 – 세포 상호 작용은 유방샘과 같은 많은 기관의 적절한 기능과 발달에 필요합니다. 연구 결과 junctional 단백질은 서로의 기능과 안정성을 조절할 수 있고 세포막에서 서로 연결되어 신호 전달을 활성화 할 수 있습니다. 현재의 원고에 제시된 프로토콜은 접합 단백질의 차별화 된 발현, 위치 및 정상적인 쥐의 혈관 발달 중 상호 작용에 대한 흥미있는 발견을 제공했다. junctional ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
IP는 캐나다 자연 과학 및 공학 연구 협의회 (NSERC # 418233-2012)의 지원을받습니다. Frans de Recherche du Québec-Santé (FRQS), Quebec Breast Cancer Foundation 경력 상 및 캐나다 재단 혁신 재단 (Canadian Foundation for Innovation)으로부터 Leader Founds 보조금을 받았다. ED는 Fondation 유니버설 Armand-Frappier에서 장학금을 받았습니다.
Materials
| Mice strain and stage | St. Constant, Quebec, Canada | C57BL/6 Femals; pregnancy day 18 (P18) and lactation day 14 (L14), Charles River Canada | |
| PBS 10X (stock) | 1) Dissolve 80g NaCl (F.W.: 58.44), 2g KCl (F.W. 74.55), 26.8g Na2HPO4•7H2O (F.W. 268.07) and 2.4g KH2PO4 (F.W.:136.09) in 800ml distilled water. 2) Adjust the PH to 7.4 3) Add water to reach to the 1 litre final volume. |
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| TBS 10X (stock) | 1) Dissolve 60.5g TRIS, 87.6g NaCl in 800ml distilled water. 2) Adjust the PH to 7.5 3) Add water to reach to the 1 litre final volume. |
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| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 1-Immunofluorescence | |||
| Freezing media | VWR International, Ville Mont-Royal, QC, Canada | 95067-840 | VMR frozen sections compound |
| Microtome | Mississauga, ON, Canada | 956640 | Microm HM525, Thermo fisher scientific HM525 NX Cryostat 115V 60Hz |
| Blades | C.L. Sturkey, Inc. Les Produits Scientifiques ESBE St-Laurent, QC, Canada | BLM1001C | High profile gold coated blades |
| Pap pen | Cedarlane, Burlington, ON, Canada | 8899 | Super PAP Pen, Thermo fisher scientific |
| Microscopic slides | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | 12-550-15 | Fisherbrand Superfrost Plus Microscope Slides |
| Formaldehyde | BioShop Canada Inc, Burlington, ON, Canada | FOR201.1 | Forlmadehyde |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA | ||
| Blocking solution | 3% BSA in TBS | ||
| Wash solution | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Polysorbate 20 | Oakville, ON, Canada | P 9416 | Tween 20, Sigma-Aldrich |
| Mounting media | Cedarlane, Burlington, ON | 17984-25(EM) | Fluoromount-G |
| First & secondary antibodies | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in Column D | E-Cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) 1/50 (Cell Signaling) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 555 (#4409s), Cell Signaling |
| First & secondary antibodies | Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in Column D | Claudin-7 (#34-9100) 1/100 (Life Technologies) with anti-rabbit IgG Fab2 Alexa Fluor 488 (#4412s) (Cell Signaling) |
| First & secondary antibodies | Santa Cruz Biotechnology, Inc, California, USA; Fischer Scientific, Burlington, ON, Canada | Mentioned in Column D | β-Catenin Antibody (C-18): sc-1496 (SANTA CRUZ) with anti-Goat IgG (H+L) Alexa Fluor 568 (#A11057), Molecular Probe (Fisher Scientific) |
| First & secondary antibodies | Life technologies, Waltham, MA, USA & Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in Column D | Connexin26 (#33-5800) 1/75 (Life Technologies) with anti-mouse IgG Fab2 Alexa Fluor 647 (#4410s) |
| Nuclei stain | Fisher Scientific, Burlington, ON, Canada | D1306 | DAPI (4',6-Diamidino-2-Phenylindole, Dihydrochloride) 1/1000 in PBS |
| Fluorescent microscope | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | Nikon A1R+ confocal microscopic laser equipped with a spectral detector | |
| Software of IF images analysis | Nikon Canada, Mississauga, On, Canada | NIS-elements software (version 4) | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Part 2-Immunoprecipitation | |||
| Triple-detergent Lysis buffer (100ml) pH=8.0 | 1) Mix 50mM TRIS (F.W. :121.14), 150mM NaCl (F.W. :58.44), 0.02% Sodium Azide, 0.1% SDS, 1% NONIdET P40, 0.5% Sodium Deoxycholate in 80ml distilled H2O. 2) Adjust the PH to 8.0 with HCl 6N (~0.5ml). 3) Adjust the volume to 100ml. Keep it in fridge. At the day of protein extraction, use 1/100 NaVo3, 1/100 protease/phosphatase inhibitor and 1/25 NAF in calculated amount of Triple detergent lysis buffer: Sodium Fluorid (stock) solution 1.25M (F.W. 41.98), Sodium Orthovanadate (stock) Solution 1M (F.W.: 183.9) |
||
| Protease/phosphatase inhibitor | Fisher Scientific, Burlington, ON | 78441 | Halt Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail, EDTA-free (100X) |
| Protein dosage | Thermo Scientific, Rockford, Illinois, USA | 23225 | Pierce BCA protein assay kit |
| Tissue grinder | Fisher Scientific, Burlington, ON | FTH-115 | Power 125, Model FTH-115 |
| Magnetic beads and stand | Millipore, Etobicoke, ON, Canada | PureProteome Protein G Magnetic Bead System (LSKMAGG02) | |
| Wash solution for IP | PBS or PBS-Tween20 0.1% depending to the step | ||
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in coulmn D | IgG Rabbit (rabbit (DA1E) mAb IgG Isotype control (#3900s) (Cell Signaling) 0.5 µl/200 µl |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in coulmn D | IgG Mouse mouse (G3A1) mAb IgG Isotype control (#5415s) (Cell Signaling) 0.5 µl/200 µl |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Sigma-Aldrich, Oakville, ON, Canada | Mentioned in coulmn D | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 4 µl/200 µl |
| Primary antibodies for immunoprecipitation | Cell Signaling, Beverly, MA, USA | Mentioned in coulmn D | E-cadherin (4A2) Mouse mAb (#14472s) (Cell Signaling) 1 µl/200 µl |
| Laemmli buffer | BIO-RAD, Mississauga, Ontario, Canada | 1610747 | 4x Laemmli Sample Buffer (Add β-mercaptoethanol following manufacturer recommendation) |
| Acidic glycine | Fisher Scientific, Burlington, ON | PB381-5 | 0.2 M glycine; adjust pH=2.5 with HCl |
| Tris | Fisher Scientific, Burlington, ON | BP152-1 | 1 M (pH=8) |
| SDS-PAGE acrylamide gels | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1610180 -5 | TGX Stain-Free FastCast Acrylamide Solutionss (7.8%, 10%, 12%) |
| Running buffer 10x | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | Tris 30.3g/glycine 144.1g /SDS 10g in 1 litre distilled water |
| Membranes | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704272 | PVDF membranes, Trans-Blot Turbo RTA Mini PVDF Transfer Kit |
| Transfer method | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1704155 | Trans-Blot Turbo Transfer System |
| Dry Milk | Smucker Food of Canada Co, Markham, ON, Canada | Fat Free Instant Skim Milk Powder, Carnation | |
| Blocking solution for blots | 5% dry milk in TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Washing solutions for blots | TBS-Tween 20 0.1% | ||
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Sigma-Aldrich, Oakville, Ontario & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | Connexin43 (#C6219) (Sigma-Aldrich) 1/2500 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Cell Signaling, Beverly, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | E-cadherin (24E10) rabbit mAb 1/1000 (#3195s) (Cell Signaling) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | Claudin-7 (#34-9100) (Life technologies) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Primary and secondary antibodies for blots (10ml) | Life technologies, Waltham, MA, USA & Abcam, Toronto, ON, Canada | Mentioned in column D | Claudin3 (#34-1700) (Life technologies) 1/1000 with HRP-conjugated Veriblot for IP secondary antibody (ab131366) 1/5000 (Abcam, Toronto, ON, Canada) |
| Luminol solution for signal detection on blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1705061 | Clarity Western ECL Blotting Substrate |
| Imaging blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | 1708280 | ChemiDoc MP imaging system |
| Analayzing blots | BIO-RAD, Mississauga, ON, Canada | ImageLab 5.2 software | |
References
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