क्रोनिक लिम्फोसाइटैटिक ल्यूकेमिया मरीजों में मिथाइल-सीपीजी-बाध्यकारी डोमेन कैप्चर-आधारित पद्धति का उपयोग करके व्यापक डीएनए मेथिलैलेशन विश्लेषण
Summary
यह काम एक अनुकूलित मिथाइल-सीपीजी-बाध्यकारी डोमेन (एमबीडी) अनुक्रमण प्रोटोकॉल का वर्णन करता है और क्रोनिक लिम्फोसाइटैटिक ल्यूकेमिया (सीएलएल) रोगियों में अलग-अलग मेथिलेटेड सीपीजी-समृद्ध क्षेत्रों की पहचान करने के लिए एक कम्प्यूटेशनल पाइपलाइन का वर्णन करता है।
Abstract
कैंसर के विकास और प्रगति के दौरान उनके यंत्रवत् कार्यों को समझने में बढ़ती हुई रुचि के कारण कैंसर में लंबे समय तक गैर-कोटिंग आरएनए (एलएनसीआरएनए) की भूमिका सबसे आगे आ रही है। इसके बावजूद, एलएनसीआरएनए के वैश्विक एपिनेटिक नियमन और कैंसर में दोहराए जाने वाले अनुक्रमों की अच्छी जांच नहीं हुई है, विशेषकर पुरानी लिम्फोसाइटैटिक ल्यूकेमिया (सीएलएल) में। यह अध्ययन एक अनूठे दृष्टिकोण पर केंद्रित है: मिथाइल बाध्यकारी डोमेन (एमबीडी) प्रोटीन का उपयोग करके डबल-फंसे हुए, मेथिलेटेड डीएनए टुकड़ों का प्रतिरक्षा-आधारित कब्जा, अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (एमबीडी-सीईसी) द्वारा पीछा किया गया। इस अध्ययन में दो पूर्वकल्पनात्मक उपसमूह (5 आईजीवीएच उत्परिवर्तित नमूनों + 5 आईजीवीएच अनमुरेटेड नमूनों) से संबंधित सीएलएल रोगी का नमूना उपयोग किया गया था विश्लेषण ने सामान्य स्वस्थ नियंत्रणों की तुलना में 5,800 हाइपमैथिलेटेड और 12,570 हाइपोमैथिलेटेड सीएलएल-विशिष्ट भिन्न मिथाइलेटेड जीन (सीएलएलडीएमजी) का पता चला है। महत्वपूर्ण रूप से, इन परिणामों ने कई सीएलएल-विशिष्ट, अलग-अलग मेथिलेटेड एलएनसीआरएनए की पहचान की, फिर सेपेटी तत्वों, और प्रोटीन-कोडिंग जीन संभावित भविष्यसूचक मूल्य के साथ यह काम एमएलडी-सीक और बायोइनफॉरमैटिक्स पाइप लाइन के लिए सीएलएल रोगी के नमूनों का उपयोग करते हुए अत्यधिक सीपीजी-समृद्ध क्षेत्रों में वैश्विक मेथिलिलेशन प्रोफाइल के व्यापक विश्लेषण के लिए विस्तृत प्रोटोकॉल की रूपरेखा है। अंत में, एक प्रोटीन-कोडन जीन और एक एलएनसीआरएनए पाइरोसेक्नेसिंग का उपयोग करके मान्य किया गया था, जो एमपीडी-सीक प्रोटोकॉल से निष्कर्षों की पुष्टि करने के लिए सीपीजी मेथिलिलेशन स्तर का विश्लेषण करने के लिए एक उच्च मात्रात्मक विधि है।
Introduction
हाल के वर्षों में वैश्विक डीएनए मेथिलिलेशन प्रोफाइल का विश्लेषण करने के लिए अगली पीढ़ी के अनुक्रमण तकनीकों का उपयोग तेजी से लोकप्रिय रहा है। जीनोम-व्यापी मेथिलिकेशन एलेक्स, जिसमें माइक्रोएरे- और गैर-माइक्रोएरे-आधारित विधियों शामिल हैं, निम्न के आधार पर विकसित किए गए: जीनोमिक डीएनए, मेथिलैक्शन-प्रतिबन्ध प्रतिबंध एंजाइम पचनों के बायसफ़ाइट रूपांतरण, और मेथिलैटेड डीएनए के इम्युनोपेरियैप्थ मिथाइल सीपीजी-विशिष्ट एंटीबॉडीज़ ।
एबरेन्ट डीएनए मेथाइलेशन, ल्यूकेमिया और लिम्फोमा के लक्षणों में से एक है, जिसमें चिरकालिक लिम्फोसाइटैटिक ल्यूकेमिया (सीएलएल) शामिल है। इससे पहले, हमारे सहित कई समूहों ने डीएलए मेथिलिलेशन प्रोफाइल को अलग सीएलएल प्रॉग्निगोस्टिक उपसमूहों और सामान्य, स्वस्थ बी सेल नियंत्रण को जीनोमिक डीएनए के बायसफ़ाइट रूपांतरण का उपयोग कर दिखाया, इसके बाद सूक्ष्म सरणी-आधारित तरीकों या संपूर्ण जीनोम अनुक्रमण 1 , 2 , 3 , <Sup वर्ग = "xref"> 4 जीनोमिक डीएनए के बिसूफाइट रूपांतरण को असमापित साइटोसिंस के डीरमिनेशन को मूत्राल में ले जाता है, जो जीनोम में संशोधित मिथाइलेटेड साइटोसिन्स छोड़ देता है। एक बार परिवर्तित होने पर, डीएनए की मेथिलिकेशन स्थिति पीसीआर प्रवर्धन और सूक्ष्म-सरणी-आधारित या पूरे-जीनोम बीसफ़ाफ़्ट अनुक्रमण (डब्ल्यूजीबीएस) जैसे विभिन्न मात्रात्मक या गुणात्मक विधियों का उपयोग करके अनुक्रमणित किया जा सकता है। यद्यपि bisulfite रूपांतरण आधारित तरीकों के कई फायदे हैं और डीएनए मेथिलिकेशन स्तरों का विश्लेषण करने के लिए विभिन्न कैंसर प्रकारों में व्यापक रूप से उपयोग किया जाता है, हालांकि इस तकनीक से जुड़े कुछ कमियां हैं। डब्ल्यूजीबीएस अनुक्रमण, एकल-आधार-जोड़ी रिजॉल्यूशन को कम मात्रा में डीएनए की अनुमति देता है और बड़ी संख्या में नमूने का विश्लेषण करने के लिए सबसे उपयुक्त विकल्प है। हालांकि, यह विधि 5 एमसी और 5 एचएमसी स्तरों के जीनोम 5 , 6 के बीच संशोधनों को अलग करने में विफल रहता है। इसके अतिरिक्त, माइक्रोएरे-आधारित विधियाँ पूरी तरह से सी प्रदान नहीं करती हैंजीनोम के अधिकतर
हमारे प्रयोगशाला 7 के हाल के एक अध्ययन में, बीसफ़्लैट रूपांतरण की बजाय, immunoprecipitation आधारित विधियों का उपयोग सीएलएल मरीजों और सामान्य स्वस्थ नियंत्रणों में वैश्विक स्तर पर अत्यधिक सीपीजी-अमीर, अलग-अलग मेथिलेटेड क्षेत्रों की पहचान करने के लिए किया गया था। Inmethyl-CpG- बाध्यकारी डोमेन (एमबीडी) अगली पीढ़ी के अनुक्रमण (MBD-seq), डबल असहाय खंडित डीएनए का संवर्धन सीपीजी मेथिलिकेशन की डिग्री पर निर्भर करता है। यह विधि bisulfite रूपांतरण पद्धति की कमियों को दूर कर सकती है और एक निष्पक्ष और पीसीआर-स्वतंत्र तरीके से सीपीजी मेथिलिकेशन की जीनोम-विस्तृत कवरेज प्रदान कर सकती है। इसके अतिरिक्त, बाइसफ़ाइट रूपांतरण-आधारित माइक्रोएरे विधियों के विपरीत, एमबीडी-सीक दोहराए जाने वाले तत्वों की मेथिलिकेशन स्थिति का विश्लेषण करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, जैसे परमाणु तत्वों (एनआईएनई), परमाणु तत्वों (एसईआर), लंबे टर्मिनल दोहराव (एलटीआरएस) आदि हालांकि, बिसूफ़ाइट रूपांतरण विधियों की तुलना में,एक एमबीडी-सीक प्रोटोकॉल को अपेक्षाकृत बड़ी मात्रा में इनपुट डीएनए की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, अनुक्रमण की गुणवत्ता पढ़ी जाती है और डेटा उपयोग किए जाने वाले एंटीबॉडी की विशिष्टता, आत्मीयता और गुणवत्ता पर निर्भर करता है।
वर्तमान अध्ययन में अगली पीढ़ी के अनुक्रमण के लिए मेथिलेटेड डीएनए को समृद्ध करने के लिए विस्तृत एमबीडी-सीक प्रोटोकॉल बताता है। यह एक वाणिज्यिक मेथिलेटेड डीएनए बाध्यकारी संवर्धन किट ( सामग्री तालिका में सूचीबद्ध) का उपयोग करता है, साथ ही सामान्य स्वस्थ नियंत्रणों की तुलना में सीएलएल-विशिष्ट हाइपर- और हाइपोमैथिलेटेड क्षेत्रों की पहचान करने के लिए मेथिलैशन अनुक्रमण डेटा को देखने और व्याख्या करने के लिए एक कम्प्यूटेशनल पाइपलाइन का उपयोग करता है। असल में, यह विधि मैथिलाटेड सीपीजी के साथ संपन्न डीएनए को निकालने के लिए मानव एमबीडी 2 प्रोटीन इंटरैक्शन के एमबीडी की क्षमता का उपयोग करता है, और इसके बाद मेथिलेटेड डीएनए के उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण के द्वारा किया जाता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
MBD-seq एक लागत प्रभावी, immunoprecipitation- आधारित तकनीक है जिसका उपयोग पूरी जीनोम-व्यापी कवरेज के साथ मेथिलैशन पैटर्न का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है। सीपीजी-समृद्ध मिथाइलेटेड डीएनए के संवर्धन में मेडीआईप सेक…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस अध्ययन को स्वीडिश अनुसंधान परिषद, स्वीडिश कैंसर सोसाइटी, नूट और एलिस वॉलनबर्ग फाउंडेशन (के.ए.डब्ल्यू।), और एफओयू वैस्ट्रा गॉटलैंड्सियनियन द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Dneasy Blood and tissue kit | Qaigen | 69504 | |
| Lymphoprep solution | A X I S-S H I E L D | 1114544 | |
| Nano drop 2000 | Thermo Fischersceintific | ||
| TE buffer PH 8 | Sigma aldrich | 93283 | |
| Bioruptor standard sonication device | Diagenode | UCD-200 | |
| TPX bioruptor tubes 1.5ml | Diagenode | C30010010-300 | |
| 3 M Sodium acetate | Diagenode | C03030002 | |
| E-gel iBase safe imager combo kit | Thermo Fischersceintific | G6465EU | |
| E-gel 2% Agarose gels | Thermo Fischersceintific | G441002 | |
| Methylminer Methylated DNA enrichment kit | Thermo Fischersceintific | ME10025 | |
| Labquake Tube Shaker/Rotators | Thermo Fischersceintific | 415110 | |
| Dynal MPC-S | Thermo Fischersceintific | A13346 | |
| Vortex mixer | VWR | 12620-848 | |
| Absolute Ethanol | Any company | ||
| 70% Ethanool | Any company | ||
| DNAse free water | Milli Q | ||
| DNA precipitant (3M sodium acetate) | Diagenode | C03030002 | |
| Safe seal 1.5ml eppendorf tubes | Eppendorf | 4036-3204 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Thermo Fischersceintific | Q32851 | |
| Qubit 0.5ml tubes | Thermo Fischersceintific | Q32856 | |
| Qubit | Thermo Fischersceintific | Q32866 | |
| Illumina Hiseq2000 Platform | Illumina | ||
| Water Bath | Grant | ||
| Heat block | grant | ||
| Tube rotater | Labquake |
References
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