Preparação em média<em> Drosophila</em> Extractos de embrião para experiências proteômicas
Summary
O objetivo deste protocolo é fornecer uma abordagem direta e econômica para a coleta de embriões de Drosophila em escala média (0,5-1 g) e a preparação de extratos de proteínas que podem ser utilizados em aplicações proteômicas a jusante, como a purificação por afinidade – espectrometria de massa (AP-MS ).
Abstract
A análise das interações proteína-proteína (IPPs) tornou-se uma abordagem indispensável para estudar processos e mecanismos biológicos, como sinalização celular, desenvolvimento de organismos e doenças. Muitas vezes, é desejável obter informações PPI usando material in vivo , para obter a visão mais natural e imparcial das redes de interação. A mosca da fruta Drosophila melanogaster é uma excelente plataforma para estudar PPIs in vivo e se presta a abordagens diretas para isolar material para experiências bioquímicas. Em particular, os embriões de moscas da fruta representam um tipo conveniente de tecido para estudar PPIs, devido à facilidade de colecionar animais neste estágio de desenvolvimento e ao fato de que a maioria das proteínas são expressas em embriogênese, proporcionando assim um ambiente relevante para revelar a maior parte dos PPIs. Aqui apresentamos um protocolo para a coleta de embriões de Drosophila em escala média (0,5-1 g), o que é uma quantidade ideal para uma ampla gama deAplicações proteômicas, incluindo a análise de PPIs por purificação por afinidade – espectrometria de massa (AP-MS). Nós descrevemos nossos projetos para gaiolas de 1 L e 5 L para coleções de embriões que podem ser facilmente e economicamente instaladas em qualquer laboratório. Nós também fornecemos um protocolo geral para a coleta de embriões e extração de proteínas para gerar lisados que podem ser usados diretamente em aplicações a jusante, como AP-MS. Nosso objetivo é fornecer um meio acessível para todos os pesquisadores para realizar as análises de PPIs in vivo .
Introduction
As telas genéticas e, mais recentemente, as abordagens genômicas revolucionaram o estudo das funções biológicas. No entanto, a informação celular importante é codificada em proteínas e seu conjunto de parceiros interagindo. Enquanto as telas modificadoras genéticas tradicionais podem identificar componentes de via limitante de taxa e recuperar interações indiretas, a força das abordagens proteômicas reside na sua capacidade de identificar redes de interação imediata completa de proteínas de interesse. A proteômica é, portanto, um método ortogonal valioso para estudar sistemas biológicos e complementa genômica, transcriptômica e telas genéticas tradicionais. A purificação por afinidade – espectrometria de massa (AP-MS) provou ser uma abordagem poderosa para estudar interações proteína-proteína (IPPs) em seu ambiente nativo em células e tecidos 1 , 2 . Este método permite a identificação de interações diretas ou indiretas em desenvolvimento específicoEm estágios ou contextos de tecido, e foi usado com sucesso para identificar múltiplos IPIs novos em uma variedade de caminhos de desenvolvimento (revisados na referência 1 ). Apesar do sucesso incontestável dos estudos PPI, a maioria deles foi realizada em células cultivadas, nas quais as proteínas de interesse "isca" foram sobre-expressadas. Existem dois problemas com o estudo de PPIs em cultura de células: primeiro, uma linha celular específica pode não fornecer um complemento completo de interações devido à falta de expressão de certas proteínas. Em segundo lugar, uma alta sobreexpressão geralmente empregada em tais análises pode levar a artefatos como o erro de administração de proteínas ou a identificação de interações falso-positivas.
Ambas estas limitações podem ser superadas através da análise de IPP in vivo . Um passo limitante em tais experiências é a disponibilidade do material de partida para a purificação de complexos de proteínas. Drosophila melanogaster tem sido usado como modelo para análise funcionalSis, e recentemente também mostrou ser um excelente sistema para estudar PPIs in vivo . A embriogênese de Drosophila representa um tipo de tecido particularmente atraente para estudar PPIs, porque os embriões podem ser facilmente coletados em grandes quantidades, e também porque a maioria dos genes (> 88%) são expressos ao longo da embriogênese, proporcionando assim um ambiente rico e in vivo para detectar informações relevantes PPIs 3 .
Tradicionalmente, estudos bioquímicos em moscas utilizaram coleções de embriões de grande escala (100-150 g), como as necessárias para a purificação de lisados funcionais de transcrição 4 , 5 . Estudos anteriores de AP-MS em Drosophila também precisavam de grandes quantidades de embriões (5-10 g), porque dependiam de uma abordagem de purificação em duas etapas, como a purificação por afinidade em tandem (TAP), com a perda associada de material em cada etapa 6 . Amoun grandeO material inicial exigiu a criação de coleções de embriões em grandes gaiolas de população, que podem ser caras (quando compradas comercialmente) e demoradas para manter e limpar 7 , 8 , 9 .
Avanços recentes no desenvolvimento de abordagens de purificação de afinidade de passo único, bem como a crescente sensibilidade dos espectrômetros de massa, reduziram a quantidade necessária de material de partida por uma ordem de grandeza. Usando tags como o péptido de ligação à estreptavidina (SBP) ou a proteína fluorescente verde (GFP) e a partir de menos de 1 g de embriões, é possível isolar as quantidades de proteína de isca e componentes interagentes que seriam suficientes para identificação por Espectrometria de massa 10 , 11 .
O objetivo do protocolo aqui apresentado é ajudar os pesquisadores a superarEu uma barreira percebida para análise bioquímica de IPPs in vivo . Para esse fim, fornecemos um procedimento simples e barato para coletar embriões de Drosophila em escala média (0,5-1 g), seguido de preparação de um passo de extratos de proteínas de células inteiras que são adequados para posterior análise por AP-MS ou outras abordagens . Nosso método baseia-se no uso de gaiolas de população feitas sob medida de 1 -L ou 5-L que podem ser facilmente produzidas por qualquer laboratório. Além disso, as condições de extração apresentadas aqui foram validadas em vários estudos, tanto em células cultivadas como in vivo 10 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 .
Protocol
Representative Results
Discussion
O protocolo apresentado aqui é um procedimento simples e geral para a criação de gaiolas de população de Drosophila a escala média e a produção de extratos de proteínas de células inteiras de embriões. Os extratos resultantes podem ser utilizados em uma variedade de aplicações a jusante, tais como purificação de complexos de proteínas em resinas de afinidade. É fundamental realizar as etapas de extração no gelo e usar uma forte inibição da protease, para minimizar a degradação das proteí…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Os autores agradecem aos membros do laboratório da Veraksa por comentários úteis sobre o manuscrito e sugestões para melhorias no protocolo. O AV foi suportado pelas concessões NIH GM105813 e NS096402. LY foi apoiado pela Bolsa de Doutorado da Universidade de Massachusetts Boston Sanofi Genzyme.
Materials
| Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Container (Pack of 3) | Home Depot | 209330 | For making 5-L cages. |
| Leaktite 5-Qt. Natural Multi Mix Lid (Pack of 3) | Home Depot | 209320 | Diameter 8.37 in. Lids for 5-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 100 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875712 | Material: Polystyrene. To be used with 1-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 150 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875714 | Material: Polystyrene. To be used with 5-L cages. |
| Fisherbrand Petri dishes with clear lid, 60 x 15 mm | Fisher Scientific | FB0875713A | Material: Polystyrene. Used during embryo dechorionation. |
| Sefar NITEX nylon mesh | Sefar | 03-180/44 | 180 micron, 44% open area, used for fly cages. |
| Milwaukee 3 in. Hole Dozer Hole Saw with Arbor | Home Depot | 49-56-9670 | 3 inch cutting tool for making 1-L cages. |
| Nalgene Wide-Mouth Straight-Sided PMP Jars with White Polypropylene Screw Closure | Fisher Scientific | 11-823-33 | For making 1-L cages. Thermo Scientific cat # 21171000. Alternative 1-L containers can be used. |
| Red Star Active Dry Yeast, 2 pound pouch | Red Star | can be purchased from Amazon.com or other suppliers. | |
| Frozen 100% Apple Juice Concentrate | can be purchased from a grocery store. Has to say "100% apple juice" on the can. | ||
| Methyl 4-hydroxybenzoate | Acros Organics | AC126965000 | also known as methylparaben or Tegosept. Used as a preservative in AJ plates. |
| IGEPAL CA-630 for molecular biology, 100 ml | Sigma | I8896 | used for preparing lysis buffer. |
| Nalgene Rapid-Flow Sterile Disposable Filter Units with CN Membrane | Fisher Scientific | 09-740-2A | 0.2 μm pore size. Used for filtering 5x lysis buffer. Thermo Scientific cat # 1260020. |
| CO-RO ROCHE cOmplete Protease Inhibitor Cocktail | Sigma | 11697498001 | Vial of 20 tablets. Used for protease inhibition in lysis buffer. |
| Corning SFCA syringe filters | Fisher Scientific | 09-754-21 | SFCA membrane, diameter 26 mm, pore size 0.45 μm. Used for filtering final extract samples. |
| BD Luer-Lok Disposable Syringes without Needles | Fisher Scientific | 14-823-2A | for filtering final extract samples. BD cat # 309604. |
| Bleach | Clorox | used for embryo dechorionation at 50% (vol/vol) in water, can be purchased at any supermarket. It is important to use the Clorox brand, as other brands may result in incomplete dechorionation or may be toxic for embryos. | |
| Corning Costar Netwell Plates | Fisher Scientific | 07-200-213 | mesh containers for embryo collections. 74 μm mesh size, 6-well. |
| Wheaton Dounce Tissue Grinders, capacity 15 ml | Fisher Scientific | 06-435B | homogenizer for embryos, with loose and tight pestles. Wheaton cat # 357544. |
References
- Veraksa, A. Regulation of developmental processes: insights from mass spectrometry-based proteomics. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 2 (5), 723-734 (2013).
- Gavin, A. C., Maeda, K., Kuhner, S. Recent advances in charting protein-protein interaction: mass spectrometry-based approaches. Curr Opin Biotechnol. 22 (1), 42-49 (2011).
- Arbeitman, M. N., et al. Gene expression during the life cycle of Drosophila melanogaster. Science. 297 (5590), 2270-2275 (2002).
- Soeller, W. C., Poole, S. J., Kornberg, T. In vitro transcription of the Drosophila engrailed gene. Genes Dev. 2 (1), 68-81 (1988).
- Kamakaka, R. T., Kadonaga, J. T. The soluble nuclear fraction, a highly efficient transcription extract from Drosophila embryos. Methods Cell Biol. 44, 225-235 (1994).
- Kyriakakis, P., Tipping, M., Abed, L., Veraksa, A. Tandem affinity purification in Drosophila: The advantages of the GS-TAP system. Fly (Austin). 2 (4), 229-235 (2008).
- Shaffer, C. D., Wuller, J. M., Elgin, S. C. Raising large quantities of Drosophila for biochemical experiments. Methods Cell Biol. 44, 99-108 (1994).
- Sisson, J. C. Culturing large populations of Drosophila for protein biochemistry. CSH Protoc. 2007, (2007).
- Caravaca, J. M., Lei, E. P. Maintenance of a Drosophila melanogaster Population Cage. J Vis Exp. (109), (2016).
- Yang, L., et al. Minibrain and Wings apart control organ growth and tissue patterning through down-regulation of Capicua. Proc Natl Acad Sci U S A. 113 (38), 10583-10588 (2016).
- Neumuller, R. A., et al. Stringent analysis of gene function and protein-protein interactions using fluorescently tagged genes. Genetics. 190 (3), 931-940 (2012).
- Veraksa, A., Bauer, A., Artavanis-Tsakonas, S. Analyzing protein complexes in Drosophila with tandem affinity purification-mass spectrometry. Dev Dyn. 232 (3), 827-834 (2005).
- Mukherjee, A., et al. Regulation of Notch signalling by non-visual beta-arrestin. Nat Cell Biol. 7 (12), 1191-1201 (2005).
- Gilbert, M. M., Tipping, M., Veraksa, A., Moberg, K. H. A Screen for Conditional Growth Suppressor Genes Identifies the Drosophila Homolog of HD-PTP as a Regulator of the Oncoprotein Yorkie. Dev Cell. 20 (5), 700-712 (2011).
- Anjum, S. G., et al. Regulation of Toll Signaling and Inflammation by beta-Arrestin and the SUMO Protease Ulp1. Genetics. 195 (4), 1307-1317 (2013).
- Degoutin, J. L., et al. Riquiqui and minibrain are regulators of the hippo pathway downstream of Dachsous. Nat Cell Biol. 15 (10), 1176-1185 (2013).
- Zhang, C., et al. The ecdysone receptor coactivator Taiman links Yorkie to transcriptional control of germline stem cell factors in somatic tissue. Dev Cell. 34 (2), 168-180 (2015).
- Lemmon, M. A., Schlessinger, J. Cell signaling by receptor tyrosine kinases. Cell. 141 (7), 1117-1134 (2010).
- Vincent, J. P., Girdham, C. H., O’Farrell, P. H. A cell-autonomous, ubiquitous marker for the analysis of Drosophila genetic mosaics. Dev Biol. 164 (1), 328-331 (1994).
- Zhai, B., Villen, J., Beausoleil, S. A., Mintseris, J., Gygi, S. P. Phosphoproteome analysis of Drosophila melanogaster embryos. J Proteome Res. 7 (4), 1675-1682 (2008).
- Franco, M., Seyfried, N. T., Brand, A. H., Peng, J., Mayor, U. A novel strategy to isolate ubiquitin conjugates reveals wide role for ubiquitination during neural development. Mol Cell Proteomics. 10 (5), (2011).
- Ramirez, J., et al. Proteomic Analysis of the Ubiquitin Landscape in the Drosophila Embryonic Nervous System and the Adult Photoreceptor Cells. PLoS One. 10 (10), 0139083 (2015).
