Protocole de numérisation de l'horloge pour l'analyse d'image: Plugins ImageJ

Summary

Cet article décrit deux nouveaux plugins ImageJ pour l'analyse d'image 'Clock Scan'. Ces plugins élargissent la fonctionnalité du programme original de base visuelle 6 et, surtout, mettent le programme à la disposition d'une grande communauté de recherche en le regroupant avec le logiciel ImageJ.

Abstract

Le protocole de balayage de l'horloge pour l'analyse d'image est un outil efficace pour quantifier l'intensité moyenne des pixels à l'intérieur, à la frontière et à l'extérieur (arrière-plan) d'une région d'intérêt convexe fermée ou segmentée, ce qui conduit à la génération d'un pixel radial intégral moyen, Profil d'intensité. Ce protocole a été développé à l'origine en 2006, en tant que script visuel de base 6, mais en tant que tel, il avait une distribution limitée. Pour résoudre ce problème et rejoindre les efforts récents similaires d'autrui, nous avons converti le code du protocole d'analyse de l'horloge d'origine en deux plugins basés sur Java compatibles avec les programmes d'analyse d'image sponsorisés par NIH et librement disponibles comme ImageJ ou Fiji ImageJ. En outre, ces plugins ont plusieurs nouvelles fonctions, élargissant encore la gamme des fonctionnalités du protocole original, telles que l'analyse de multiples régions d'intérêt et les piles d'images. La dernière caractéristique du programme est particulièrement utile dans les applications dans lesquelles il est important de déterminer les changements liésÀ l'heure et à l'emplacement. Ainsi, l'analyse de l'analyse de l'horloge des piles d'images biologiques peut potentiellement être appliquée à l'épandage de Na ⁺ ou Ca ⁺⁺ dans une seule cellule, ainsi qu'à l'analyse de l'activité d'étalement ( par exemple , les ondes de Ca ⁺⁺ ) dans les populations synaptiquement Des cellules couplées à la jonction ou à l'intervalle. Ici, nous décrivons ces nouveaux plugins d'analyse de l'horloge et montrons quelques exemples de leurs applications dans l'analyse d'image.

Introduction

Le but de ce travail est de présenter un protocole de numérisation de l'horloge sans plateforme et accessible gratuitement à tout chercheur intéressé par ce type d'analyse d'image. Le protocole Clock Scan a été développé à l'origine en 2006 ¹ , dans le but d'améliorer les méthodes existantes de quantification de l'intensité des pixels dans des régions d'intérêt convexes (ROI), une méthode qui présente une meilleure capacité d'intégration et une meilleure résolution spatiale. Au cours de l'acquisition, le protocole collecte séquentiellement de multiples profils radiaux d'intensité de pixels, scannés du centre ROI à sa bordure ou à une distance prédéterminée en dehors du ROI afin de mesurer l'intensité du pixel "fond". Le protocole évolue ces profils selon le rayon de la cellule, mesuré dans le sens de la numérisation. Ainsi, la distance entre le centre et le ROI de chaque balayage radial individuel est toujours de 100% de l'échelle X. Enfin, le programme s'approche de cet individuAl dans un profil d'intensité de pixel radial intégral. En raison de la mise à l'échelle, le profil moyen d'intensité de pixel, produit par le protocole "Clock Scan", ne dépend ni de la taille du ROI ni, dans des limites raisonnables, sur la forme du ROI. Cette méthode permet une comparaison directe ou, si nécessaire, une moyenne ou une soustraction de profils de ROI différents. Le protocole permet également de corriger les profils d'intensité des pixels intégrés, de n'importe quel objet pour le bruit de fond, par une simple soustraction de l'intensité moyenne des pixels situés à l'extérieur de l'objet. Bien qu'il ne soit testé que dans des échantillons biologiques, notre protocole fournit un ajout précieux à d'autres outils d'analyse d'image existants utilisés dans les études d'images de processus physiques ou chimiques disposés autour d'un point d'origine (comme la diffusion de substances à partir d'une source ponctuelle ) ¹ .

Cependant, la principale limitation de la méthode d'analyse d'image originale était que le protocole était devA évolué en tant que Visual Basic 6 (VB6) (code et, par conséquent, il était dépendant de la plate-forme et difficile à distribuer (nécessitant VB6). Pour résoudre ce problème et rejoindre les efforts récents similaires d'autres enquêteurs ² , nous avons converti l'analyse de l'horloge VB6 Code de programme dans deux plugins basés sur Java, compatibles avec les programmes d'analyse d'image open-source et indépendant de la plate-forme, NIJ et libre de disponibilité, ImageJ ³ et Fiji ImageJ ^4. De plus, ces plugins ont maintenant plusieurs nouvelles fonctions qui augmentent la capacité Du protocole d'origine pour traiter de multiples ROI et des piles d'images. De nombreuses applications d'analyse d'image ne conviennent pas, en ce qui concerne l'analyse statistique de plusieurs objets, et souvent, seules des données représentatives sont affichées. Avec le plugin Multi Clock Scan ImageJ, Il est possible de faciliter l'analyse simultanée d'objets multiples. Une évaluation statistique robuste des données microscopiques,En ce qui concerne la distribution de l'intensité du signal dans des cellules / objets individuels, est maintenant possible avec cette extension de plugin. Ici, nous décrivons les plugins Clock Scan et montrons des exemples de leurs applications dans l'analyse d'image.

Protocol

1. Installation du logiciel

1. Installez les dernières versions de Java groupé et ImageJ ou Fiji ImageJ comme recommandé sur les sites respectifs (voir la table des matériaux pour les liens vers les sites Web correspondants). Dans le texte ci-dessous, les deux programmes sont appelés «ImageJ».
2. Copiez les fichiers "Clock_Scan-1.0.1. Jar" et "Multi_Clock_Scan-1.0.1.jar" en utilisant le lien fourni dans la table des matériaux et collez-les dans le répertoire de plugins ImageJ. Vous pouvez également utiliser l'option "Plugins | Installer le plugin" pour installer ces fichiers après avoir été enregistrés sur le disque dur de l'ordinateur.

2. Analyse de l'analyse de l'horloge

1. Plugin d'analyse de l'horloge standard ( Figure 1 ):
   1. Utilisez la commande de menu "Fichier | Ouvrir" ImageJ pour ouvrir une image d'intérêt.
   2. Cliquez sur l'outil «polygone» ou «sélection de ligne segmentée»Outil, puis dessinez sur l'image pour décrire l'ensemble du ROI ou un segment de cette région. Voir la figure 1 A pour un exemple de sélection de polygone (contour pointillé interne).
      REMARQUE: D'autres outils de sélection, disponibles dans le logiciel (sélection rectangulaire, ovale et ligne droite) peuvent également être utilisés.
   3. Sélectionnez "Plugins | Clock Scan" dans le menu pour ouvrir la fenêtre d'option pop-up du protocole d'analyse de l'horloge standard. Notez que cette commande ouvrira également la fenêtre ROI Manager avec le contour ajouté automatiquement.
   4. Utilisez la fenêtre d'option du plugin pour effectuer les opérations suivantes.
      1. Examinez et modifiez les coordonnées X et Y du centre ROI (calculé automatiquement en tant que coordonnées du centre de masse physique) en utilisant des barres de défilement ou en changeant les valeurs dans les cases de saisie correspondantes. Voir la figure 1 B.
      2. Selon la quantité de la région de fond en dehors de l'objet shoVous devez être couvert par la numérisation, régler les limites de numérisation en utilisant la barre de défilement "limite de numérisation". Voir la figure 1 A.
         REMARQUE: la limite de numérisation est le nombre fractionnaire représentant la distance à parcourir dans la direction de l'objet dans une direction donnée; La valeur par défaut est 1.20, indiquant que la longueur de balayage sera 20% plus longue que le rayon de l'objet dans la direction de balayage; Voir la figure 1 A , ligne pointillée extérieure).
      3. Modifiez la sortie du plugin à l'aide des cases à cocher "rayon réel", "soustraire l'arrière-plan", "polar transform" et / ou "trame avec déviation standard".
      4. Cliquez sur "OK" pour exécuter le plugin. Voir la figure 1 C-H .
         REMARQUE: Des exemples de la sortie du protocole avec "tracé avec écart type" et "transformée polaire" ou "rayon réel" et "polar transfLes options "orm" sélectionnées sont représentées respectivement dans la Figure 1 C et 1D et Figure 1 E et 1F . Notez que les valeurs de l'écart type (SD) calculé représentent la variation entre les balayages individuels de l'intensité des pixels radiaux de l'objet. Notez également "la sélection ROI Longueur "dans la fenêtre du plugin, qui affiche les informations sur la longueur de contour ROI mesurée en pixels.
   5. Dans le «Parcours de profil de balayage de l'horloge» généré, utilisez la commande «Liste» pour tracer les valeurs affichées dans deux colonnes de données X et Y pour les images à échelle de gris et dans les colonnes de données X et quatre Y pour les images RVB dont Y0, Les colonnes Y1, Y2 et Y3 seront remplies avec des valeurs d'intensité de pixel de canal de couleur intégrales et individuelles (rouge, vert et bleu).
2. Multiple ROI Clock Scan plugin - travail avec plusieurs ROI ( ):
   1. Ouvrez une image contenant plusieurs ROI.
   2. Ouvrez le gestionnaire de ROI en cliquant sur "Analyser | Outils | Gestionnaire de ROI".
   3. Déterminer séquentiellement (voir l'étape 2.1.2) et ajouter chaque ROI au gestionnaire de ROI en cliquant sur "Ajouter" dans la fenêtre du gestionnaire de ROI; Faites ceci pour tous les ROI dans l'image. Utilisez la commande "Analyser | Mesurer" si les mesures de ROI sont intéressantes.
      1. Voir la figure 2 A pour un exemple de sélections de lignes segmentées multiples et la figure 2 E pour un exemple de sélections multiples de polygones.
   4. Sélectionnez "Multi Clock Scan" dans le menu "Plugins" pour ouvrir la fenêtre contextuelle des options de protocole.
   5. Utilisez la fenêtre d'option de protocole pour effectuer les opérations suivantes.
      1. Si nécessaire, réinitialiser la limite de numérisation selon l'étape 2.1.4.2; La valeur par défaut est 1.20.
      2. Si nécessaire, sélectionnez l'optionPour tracer le profil moyen de balayage de l'horloge avec des barres SD en cochant la case "Parcourir avec écart type". Voir la figure 2 C et D.
         REMARQUE: Les valeurs SD calculées représenteront une variation entre les profils intégrés d'analyse de l'horloge des différents objets. Aussi, notez la ligne dans la fenêtre du plugin affichant des informations sur le "nombre de ROI sélectionnés".
      3. Cliquez sur "OK" pour exécuter le protocole.
   6. Dans le «Trace de profil de numérisation d'horloge» généré, utilisez la commande «Liste» pour tracer les valeurs affichées dans la fenêtre «Valeurs de tracé». Voir la légende de la fenêtre "Multi Clock Scan Profile Tram" pour la désignation de la colonne par canal couleur.
   7. Notez que les ROI sont numérotés et que leurs profils de numérisation d'horloge pour un canal de couleur donné sont tracés dans la même séquence dans laquelle les ROI ont été décrits et ajoutés au «Gestionnaire de ROI».
3. MulTiple ROI Clock Scan plugin - travail avec une pile d'images ( Figure 3 ):
   1. Ouvrez une image-pile d'intérêt.
   2. Ouvrez le gestionnaire de ROI en cliquant sur "Analyser | Outils | Gestionnaire de ROI".
   3. Décrivez le ROI des images dans la pile et ajoutez-la au gestionnaire de ROI comme décrit aux étapes 2.1.2 et 2.2.3. Utilisez la commande "Analyse | Mesurer" si les paramètres de ROI sont intéressants.
   4. Sélectionnez "Multi Clock Scan" dans le menu "Plugins" pour ouvrir la fenêtre contextuelle des options de protocole.
   5. Utilisez la fenêtre d'option de protocole pour effectuer les opérations suivantes.
      1. Réinitialiser la limite de numérisation comme décrit à l'étape 2.1.4.2; La valeur par défaut est 1.20.
      2. Sélectionnez l'option pour tracer le profil d'analyse de l'horloge moyenne avec les barres SD en cochant la case "Parcourir avec l'écart type".
         NOTE: Les valeurs SD calculées représenteront une variation entre les différentes instances de l'objet sélectionné dans l'image staCk. Notez également la ligne dans la fenêtre du plugin affichant des informations sur le "nombre d'images dans la pile".
      3. Cliquez sur "OK" pour exécuter le protocole.
   6. Dans la fenêtre "Traçage de balayage de l'horloge", cliquez sur "Liste" pour tracer les valeurs affichées dans la fenêtre "Valeurs de tracé", où le numéro de colonne Y représente la position de l'image dans la pile - 1.

Representative Results

Les images utilisées ici à titre d'illustration sont tirées des bases de données créées lors de nos précédentes études biologiques sur les cellules et les tissus ^{5 , 6 , 7} et de l'Allen Mouse Brain Atlas ⁸ . Les deux plugins ont été testés avec succès à l'aide de l'environnement ImageJ 1.50i / Java 1.8.0_77, ImageJ 2.0.0-rc-44 / 1.50e / Java 1.8.9_66 et Fiji ImageJ 2.0.0-rc54 / 1.51g / Java 1.8.0_66.

La figure 1 montre les résultats représentatifs de l'analyse d'image avec un plugin standard Clock Scan. Pour les deux plugins, le code de base et les étapes principales de la procédure d'analyse de l'horloge sont essentiellement les mêmes que ceux décrits dans le protocole original ¹ . En bref, après le ROI ou un segment du ROI est décrit sur l'image ( Figure 1 A , contour jaune intérieur) et un centre de contour est déterminé (automatiquement ou manuellement, à l'aide de la fenêtre d'option du plugin, Figure 1 B ), le balayage radial de l'intensité des pixels commence dans une direction du centre au premier pixel du Le contour de la cellule et se poursuit dans le sens des aiguilles d'une montre par pixel le long du contour ( Figure 1 A , vecteur droit et flèche incurvée, respectivement) jusqu'à ce que tous les rayons ROI soient scannés. Pour quantifier l'intensité de l'arrière-plan ROI, la longueur de chaque balayage radial peut être définie pour dépasser le rayon du ROI dans la direction de la numérisation par un nombre fractionné prédéfini (0,2 ou 20% du rayon en défaut pour la valeur du plugin Clock Scan , Ligne jaune extérieure de la figure 1 A ). Les profils radiaux collectés sont ensuite alignés par mise à l'échelle sur les rayons correspondants et en moyenne pour produire le profil intégral d'intensité de balayage d'horloge en 256 niveaux d'intensité des unités d'échelle de gris ( figure 1 C ). Pour les images RVB, les deux plugins produisent automatiquement des profils d'intensité de pixels radiaux intégrés indépendants pour chaque canal de couleur (256 niveaux d'intensité des couleurs rouge, verte et bleue) en plus d'un profil de couleur combiné.

Par défaut, l'échelle x du profil d'intensité de pixel d'analyse de l'horloge représente le rayon de ROI normalisé, avec 100% de l'échelle représentant les pixels situés à la frontière du ROI ( Figure 1 C ). Le profil représenté à la figure 1 C a été généré avec l'option "tracé avec déviation standard" sélectionnée et, par conséquent, le graphique affiche également le SD calculé pour chaque point de données le long de l'échelle X du profil. Lorsque l'option "soustraire l'arrière-plan" est sélectionnée, l'intégralité du profil d'intensité est corrigée pour l'arrière-plan nonIse par soustraction point par point de l'intensité moyenne des pixels situés entre la bordure ROI et la limite limite de balayage (ligne jaune externe dans la Figure 1 A , données non représentées). Si l'option "transformée polaire" est sélectionnée, le plugin de recherche d'horloge génère une fenêtre de sortie supplémentaire. Il contient une transformée polaire de l'image de la région sélectionnée, y compris le territoire limite de balayage, dans lequel l'image est modifiée dans chaque direction de balayage radial de telle sorte que la distance entre le centre et la bordure des objets soit toujours normalisée à 100 % Et représenté par 100 pixels. Indépendamment de la taille réelle de l'objet, les dimensions verticales et horizontales de son image de transformation polaire sont deux fois la limite de balayage en pixels (240 pixels x 240 pixels dans l'exemple représenté sur la Figure 1 D ). Enfin, en sélectionnant l'option «rayon réel», il en résultera la génération de l'analyse de l'horloge prOfile et une image de transformation polaire, mise à l'échelle par le rayon moyen réel de l'objet et dans les unités d'étalonnage spatial de l'image originale ( figures 1E et F , respectivement).

Les figures 1G et H illustrent des options d'analyse d'image supplémentaires en utilisant la transformation polaire indépendante de la taille et de l'objet et les commandes et outils ImageJ intégrés. Des exemples de commandes, qui pourraient être considérées comme utiles pour certains types d'analyse d'image, sont l'outil de ligne segmentée et la commande "Analyser le profil de tracé" ( Figure 1 G ) et la commande "Analyser la parcelle de surface" ( figure 1 H ).

Les figures 2 et 3 montrent des résultats représentatifs de l'analyse d'image avec le plugin Multi Clock Scan. La sortie duLe plug-in de balayage multi-horloge se compose de deux graphiques: le premier graphique montre les profils individuels d'analyse de l'horloge des objets sélectionnés ( Figure 2 C ) et le deuxième graphique affiche la moyenne de ces profils individuels d'analyse de l'horloge (± SD, optionnel, Figure 2 D ) . Pour les images RVB ( Figure 2 E ), le profil de balayage de l'horloge calculé pour chaque canal de couleur individuel est également affiché pour chaque ROI sélectionné ( Figure 2 F ), et la moyenne est calculée dans un canal donné pour tous les objets sélectionnés ( Figure 2 G ) . De même, les profils individuels et moyens d'analyse de l'horloge pour les objets dans la pile d'images sont affichés après avoir effectué l'analyse de la pile de l'horloge ( figures 3A-3D , le profil de balayage de l'horloge moyen n'est pas affiché). Comme indiqué précédemment, le numériqueToutes les données sont utilisées pour générer ces parcelles en exécutant la commande "Liste" de l'intrigue.

La figure 4 illustre une application supplémentaire de l'option de transformation polaire dans le plugin Clock Scan: sa pertinence pour l'enregistrement d'image et les opérations de recouvrement. Sur cette figure, des transformations polaires indépendantes de la taille et de la forme ROI ont été utilisées pour comparer la distribution du marquage par fluorescence des neurones exprimant la pompe α3 sodium / potassium-ATPase entre différentes régions corticales de la souris, l'image atlas montrant les bordures et l'organisation anatomique de Ces régions ( figures 4A à 4B ). Avec un protocole de vérification de l'horloge, l'enregistrement de référence (atlas) et les images réelles requises pour une telle comparaison sont limitées à une procédure simple d'alignement des images, décrivant la structure d'intérêt dans les deux images, puis générant une taille et une forme de ROI, Transformées polaires indépendantes.Dans l'exemple montré dans la figure 4 , une comparaison des transformations polaires démontre clairement une répartition non uniforme des cellules marquées dans le cortex cérébral de la souris, leur densité étant spécifiquement élevée dans les zones superficielles de la couche 2 / 3rds du cortex moteur, partie dorsale Du cortex insulaire agranulaire, du cortex orbitaire latéral et des couches profondes du cortex moteur ( figures 4C-4D ).

Figure 1 : Exemple représentatif d'application du plugin de numérisation d'horloge pour l'analyse d'image. ( A ) Image de lumière fluorescente d'une section d'un ganglion de racine dorsale de rat immunostained pour l'isoforme α3 de Na + / K + - ATPase (α3 NKA, voir Schneider et al., ³ pour les détails du traitement et de la coloration des tissus).L'un des profils neuronaux, avec sa bordure fortement marquée pour α3 NKA (blanc), est décrit à l'aide d'un outil de ligne polygonale (ligne jaune intérieure). Les limites de balayage radial (flèche blanche) (ligne jaune extérieure) ont été réglées sur 120% du rayon de l'objet, du centre de l'objet (point blanc) au premier pixel du contour, comme indiqué dans le panneau B (barre de défile de la limite de numérisation). ( B ) Capture d'écran de la fenêtre d'option principale du plugin Clock Scan. ( C ) Parcelle du profil intégral d'intensité de pixel de la cellule montrée dans le panneau A (moyenne de 706 profils de balayage radial, voir longueur de contour en B; les barres verticales sont des barres SD). ( D ) - Image de transformation polaire du profil cellulaire étudié. ( E ) Profil de balayage d'horloge de la même cellule obtenue avec l'option "rayon réel" sélectionnée. Notez que, contrairement au profil représenté en C, l'échelle x de ce profil affiche des unités d'étalonnage spatial réelles (μm). ( F ) Transformation polaire de la même cellule obtenue avec le L'option "rayon réel" est sélectionnée. Notez que l'échelle de cette transformation est maintenant dans des unités d'étalonnage spatial réel (μm). ( G ) La bordure de la transformation polaire, montrée en D, a été décrite à l'aide de l'outil de ligne segmentée (l'épaisseur de la ligne a été définie sur 10 pixels ou 10% de la longueur de balayage radial) et analysée. La commande "Analyse | Profil de traçage" a été exécutée pour mesurer les changements dans l'intensité d'étiquetage moyenne le long de la bordure de l'objet (chaque point de données du graphique représente l'intensité moyenne de tous les pixels dans la largeur de la ligne de sélection). ( H ) La commande "Analyse | Surface Plot" a été appliquée à l'image de transformation polaire montrée dans le panneau D pour créer une représentation 3D de l'intensité d'étiquetage de l'objet. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

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Figure 2 : exemple représentatif Application de l'utilisation de Multi Clock Scan Plugin pour l'analyse d'image. ( A ) Quatre champs de vision ont été capturés dans la section de ganglion de racine dorsale de rat immunostained pour α3 NKA (voir la figure 1, une légende). Pour simplifier l'utilisation du plugin de balayage multi-horloge, ces images ont été placées dans une pile puis converties en une seule image en utilisant la commande "Image | Stacks | Make Montage". Les lignes et les chiffres rouges indiquent une sélection de lignes segmentées de cinq régions d'intérêt sur cette image. ( B ) Une capture d'écran de la fenêtre Multi Clock Scan est affichée lorsque le plugin est utilisé pour analyser une image à échelle de gris. ( C ) Profils de balayage de l'horloge individuel de cinq ROI figurant dans le panneau A. ( D ) Profil moyen d'analyse de l'horloge pour les ROI sélectionnés (panneauA) avec des barres SD (option "tracé avec écart type" sélectionné). ( E ) Image RVB de lymphocytes pré-virus de souris cultivés, marqués avec 4,6-Diamidino-2-phénylindole (DAPI, tache nucléaire, bleu) et avec des anticorps marqués par fluorescence pour β1-intégrine (vert) et F-actine (rouge , Voir Dobretsov et al., ⁷ pour la technique de culture cellulaire et Yuryev et al., ¹¹ pour la coloration des détails). Onze cellules (voir les étiquettes numériques) ont été décrites à l'aide de l'outil de sélection de polygone ImageJ. Les panneaux à droite montrent la vue en canal vert et rouge de la cellule n ° 7 (sélection rectangulaire sur le panneau de gauche) après que la fonction de menu "Image | Couleur | Diviser les chaînes" a été exécutée. ( F ) Les profils individuels d'analyse de l'horloge cellulaire (les profils de chaînes de couleurs composées, rouges, vertes et bleues sont représentés respectivement par des lignes noires, rouges, vertes et bleues). ( G ) Profils moyens d'analyse de l'horloge pour les onze ROI sélectionnés dans le panneauE. Désignations des couleurs comme dans le panneau G (aucune option de traçage avec déviation standard n'a été utilisée pendant la procédure de numérisation multi-horloge). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3 : Plugin de numérisation multi-horloge et analyse des piles d'images. ( A ) Montage des images sélectionnées et "sauvegardées en tant que pile". Une image d'un neurone ganglionnaire de racine dorsale capturée avec un contraste différentiel d'interférence (microscopie DIC) s'affiche dans le premier cadre. Les images ultérieures ont été acquises en utilisant une microscopie à fluorescence par épi-illumination pour surveiller la concentration de calcium intracellulaire à différents intervalles de temps, avant et après la stimulation électrique de la cellule. Les chiffres à côté du respectL'image e indique l'heure dans ms ⁶ . La bordure de la cellule a été esquissée à l'aide de l'image DIC de la pile (trame supérieure gauche; astérisque indique la pipette de patch-clamp utilisée pour l'enregistrement et le remplissage de la cellule avec le colorant sensible au calcium Oregon Green BAPTA-1 (OGB-1) ), Puis utilisé pour exécuter la procédure de numérisation multi-horloge sur les images restantes. ( B ) Capture d'écran de la fenêtre Multi Clock Scan, lorsque le programme est exécuté sur une pile d'images. ( C ) Profils de balayage de l'horloge du signal fluorescent OGB-1 à différentes distances du centre de la cellule (% du rayon) et à différents moments avant et après la stimulation électrique (légende, en ms). Pour préparer ces graphiques, un logiciel graphique professionnel a été utilisé. ( D ) Modifications de l'intensité du signal OGB-1 avec le temps dans les régions de sous-membrane et de cellules cytoplasmiques plus profondes (cercles et lignes rouges et noires, respectivement). Pour obtenir ces données, la moyenne et la SD ont été calculées pour chaque point de donnéesEntre 20-40% et 70-90% de l'échelle x de chaque profil de balayage d'horloge montré dans le panneau C (zones ombrées). Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4 : Exemple d'utilisation du plugin de numérisation de l'horloge dans l'enregistrement et la superposition d'images. ( A et B ) Captures d'écran de la plaque 29 à partir de la section coronal (Allen Brain Brain Atlas) et une section vibratome de 200 μm d'épaisseur du cerveau de souris incorporé à la gélatine coupée approximativement au même niveau que l'image de l'atlas. La souris transgénique utilisée dans cet exemple exprime la protéine fluorescente ZsGreen sous le promoteur de α3NKA, pour identifier les neurones exprimant α3NKA ² . Pour déterminer leLes régions corticales qui sont spécifiquement enrichies avec ces neurones (points lumineux sur l'image dans le panneau B), la zone corticale entière a été décrite (lignes pointillées jaunes) à partir des deux images avec le même point de référence (mi-frontière entre le cortex et l'olfactif Bulle; flèches). ( C ) Les panneaux représentent (de gauche à droite): Clock Scan polar transforme le ROI, sélectionné dans l'image atlas (panneau A), à l'image de la section du cerveau de la souris (panneau B) et de la superposition de ces deux images de transformation ("Image Commande Overlay | Add Image "avec un paramètre d'opacité de 50%). ( D ) Les mêmes images que dans le panneau C, mais avec les limites des principales régions corticales (comme indiqué dans l'atlas) décrites dans deux autres images de transformation à l'aide du polygone ImageJ, des outils de sélection de ligne segmentée et des "Analyser | Outils | Synchroniser Windows" commander. Les abréviations sont les mêmes que dans l'image originale de l'atlas du cerveau: Moteur primaire et secondaire (MOp, MO), insulaire agranulaire, dorLa partie sal (AId), le cortex orbitaire latéral, ventro-latéral et médical (ORBI, ORBvl, ORBm), préliminaire (PL), cingulate antérieur, cortex de partie dorsale (ACAd). Les chiffres dans la zone MOs se réfèrent aux principales couches corticales, qui peuvent être distinguées dans le cortex moteur de la souris au niveau du cerveau coronal approprié. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Discussion

Protocole de numérisation d'horloge: le protocole de numérisation d'horloge est un outil rapide et simple d'analyse d'image. Les avantages de ce protocole, par rapport aux approches communes existantes de l'analyse d'image (telles que les analyses linéaires d'intensité de pixels ou le calcul de l'intensité moyenne des pixels du ROI) ont été décrits en détail dans les publications précédentes ^{1 , 9} . En bref, ce protocole permet de générer des profils d'intensité de pixel radial intégral en quantifiant l'intensité des pixels situés à différentes distances du centre ROI tel que la bordure de l'objet ou un emplacement prédéterminé en dehors de l'objet (arrière-plan). En raison de ce dernier, les profils de numérisation de l'horloge de chaque ROI peuvent toujours être corrigés pour leur fond immédiat, ce qui (dans les applications biologiques) rend ce profil moins dépendant des non uniformités locales, à l'intérieur ou à l'échantillon ou à l'échantillon. Dans l'étiquetage / la coloration, ainsi que l'instabilité dansL'intensité de la source de lumière du microscope ou les temps d'exposition aux lampes fluorescentes. La taille de l'objet et l'indépendance de la forme des profils d'analyse de l'horloge élargissent encore la zone d'application de ce protocole en permettant les comparaisons des différents objets, ainsi que la correction par soustraction point par point des profils de contrôle "positif" et "négatif" objets.

Plugins de numérisation de l' horloge: la principale limitation pour la distribution et le partage du protocole d'origine était la dépendance à la plate-forme de son code qui a été développé avec Visual Basic 6.0 (VB) ^{1 , 9} . Ce problème a récemment été abordé par l'un des groupes de recherche du Leibniz Institute of Molecular Pharmacology, en Allemagne, en développant un plugin Fuji ImageJ Clock Scan similaire ² . Le plugin de l'Institut Leibniz reproduit la fonctionnalité de base de l'horloge d'origine dans sa capacité à générer des informationsProfils de balayage radial pour le ROI en forme convexe et, en plus, il peut traiter des segments de contours (arcs). Cependant, la limite de numérisation du profil généré par leur plugin ne peut être définie qu'à 100% (la bordure de l'objet), ce qui signifie que l'intensité du pixel d'arrière-plan ne peut pas être quantifiée. En outre, il n'a pas la capacité de générer des transformées polaires, de travailler avec des canaux de couleurs différents dans des images RVB, ou de travailler avec des piles d'images et de traiter des ROI multiples. En comparaison, les deux nouveaux plugins, décrits ici, reproduisent pleinement la capacité du code VB d'origine ( c.-à-d . La génération de profils intégrés d'intensité de pixels d'analyse de l'horloge avec affichage optionnel de SD et / ou de soustraction d'arrière-plan, ainsi que le traitement de différents canaux de couleurs Images RVB). En outre, ils peuvent analyser un ROI segment / en forme d'arc (fonctionnalité introduite dans le plugin Fuji ImageJ développé au Leibniz Institute of Molecular Pharmacology ² ). En outre,Ces plugins développent l'utilité des programmes précédents en générant des transformations d'images ROI polaires indépendantes de taille et de forme, qui peuvent être utilisées dans des applications nécessitant un enregistrement d'image. Enfin, le plugin de balayage multi-horloge facilite efficacement l'analyse de l'horloge de plusieurs ROI situés dans la même image ou dans une pile d'images. Cette dernière nouvelle fonctionnalité du programme est particulièrement utile dans les applications dans lesquelles il est important de déterminer les changements liés au temps et à l'emplacement.

Limitations et dépannage: la limitation majeure de la méthode de numérisation de l'horloge est l'exigence de sélectionner un ROI convexe. Le profil de balayage de l'horloge n'a pas de sens dans les situations où l'un des balayages radiaux franchit le schéma ROI plus d'une fois. Cela rendrait impossible la normalisation de la longueur d'un tel balayage radial par rapport à la distance du centre à la frontière ROI. Une autre limitation est que l'information sur le profil de l'analyse de l'horloge est progressiveDiminue considérablement dans le ROI dépourvu de symétrie radiale. Cependant, au moins en partie, ces deux limitations peuvent être surmontées par l'analyse de segments sélectionnés (arcs) de ROI complexes et asymétriques. L'utilisation de l'analyse de segment est également recommandée dans les cas où des sections du territoire de fond contiennent des caractéristiques marquées, ce qui peut affecter la procédure de soustraction d'arrière-plan (voir la Figure 2A pour un exemple de sélection pour l'analyse de ces segments de cellules qui ne sont pas confrontés à d'autres cellules marquées). Enfin, si l'analyse des images composites contenant plus de 3 canaux de couleur est nécessaire, les canaux de couleur de ces images doivent être divisés avant d'exécuter le plugin.

Orientations futures: L'amélioration future de la fonctionnalité de ces plugins comprendra, mais sans s'y limiter, la mise à jour du code pour combiner les fonctionnalités des plug-ins horloge et multi-horloge dans un plugin. Les algorithmes de co-localisation des couleurs (tels que les algorithmes basSur les calculs de la corrélation de Pearson ou les coefficients de partage de Manders) et le développement du plugin pour devenir capable de travailler avec des ROI multiples sélectionnés dans différentes images ou dans différentes tranches dans une pile d'images (la version actuelle des plugins permet d'analyser plusieurs Les ROI sélectionnés dans une image ou un ROI sélectionné pour toutes les images dans la pile) seront implémentés. Les auteurs apprécieront également toutes les suggestions des utilisateurs du plugin et les rapports sur les problèmes rencontrés lors de l'utilisation des plugins existants.

Conclusion: l'analyse de l'horloge est un outil prometteur pour les études d'imagerie dans de nombreuses régions de la biologie, de l'analyse de l'étiquetage cellulaire statique avec différents marqueurs aux études de propagation de Na ⁺ ou Ca ⁺⁺ , dans une seule cellule ainsi que pour la Analyse de l'activité d'étalement ( p. Ex. , Ondes de Ca ⁺⁺ ) dans des populations de cellules connectées de façon synaptique ¹⁰ , ¹¹ ou des cellules couplées à la jonction ¹² . Les autres domaines potentiels d'application de l'analyse de l'horloge comprennent l'analyse d'image médicale (images ultrasonores des vaisseaux sanguins, images de tomodensitométrie et sections transversales osseuses), astronomie (imagerie spinale et radiale radiale), chimie (diffusion à partir d'une source ponctuelle) La physique (analyse du diagramme de diffraction), la foresterie (analyse des anneaux de tige des arbres pour déterminer l'âge de l'arbre ainsi que les périodes de temps sec et mauvaise fertilisation), l'ingénierie (corrosion des tuyaux métalliques) et la climatologie (analyse de l'image radar).

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Computer	Any		compatible with software listed below
ImageJ or Fiji ImageJ	NIH	https://imagej.nih.gov/ij/ or https://fiji.sc/	bundled with Java 1.8 or higher
Clock-scan plugins	freeware	https://sourceforge.net/projects/clockscan/	Clock_Scan-1.0.1 jar and Multi_Clock_Scan-1.0.1/ jar
Origin 9.0	OriginLab	Northampton, MA, USA	This program was used to generate some graphs of the original Clock Scan data. Any other graphic software can be used to perform this function