Dépistage des essais pour caractériser les nouveaux régulateurs endothéliales impliqués dans la réponse inflammatoire
Summary
Endothélium vasculaire contrôle étroitement le recrutement des leucocytes. Extravasation de leucocyte inadéquate contribue aux maladies inflammatoires humaines. La recherche de nouveaux éléments régulateurs d’activation endothéliale est donc nécessaire de concevoir des traitements améliorés pour troubles inflammatoires. Nous décrivons ici une méthodologie globale afin de caractériser les nouveaux régulateurs endothéliales qui peuvent de modifier leucocytes traite au cours de l’inflammation.
Abstract
La couche endothéliale est essentielle au maintien de l’homéostasie du corps par le contrôle de nombreuses fonctions différentes. Régulation de la réponse inflammatoire par la couche endothéliale est cruciale pour lutter efficacement contre entrées nuisibles et aider à la restauration des zones endommagées. Lorsque les cellules endothéliales sont exposés à un environnement inflammatoire, tels que le composant externe de la membrane des bactéries à Gram négatif, lipopolysaccharide (LPS), ils expriment des cytokines pro-inflammatoires solubles, tels que Ccl5, Cxcl1 et Cxcl10 et déclencher le activation des leucocytes circulants. En outre, l’expression des molécules d’adhésion E-sélectine, VCAM-1 et ICAM-1 sur la surface endothéliale permet l’interaction et l’adhésion des leucocytes activés à la couche endothéliale et finalement l’extravasation vers les tissus enflammés. Dans ce scénario, la fonction endothéliale doit être étroitement contrôlée car l’activation excessive ou défectueuse dans le recrutement des leucocytes pourrait conduire à des troubles inflammatoires liés. Étant donné que beaucoup de ces troubles n’ont pas un traitement efficace, des stratégies nouvelles en mettant l’accent sur la couche vasculaire doivent être étudiés. Nous vous proposons les tests complets qui sont utiles à la recherche de nouveaux régulateurs endothéliales qui modifient la fonction leucocytaire. Nous analysons une activation endothéliale en utilisant des objectifs d’expression spécifiques impliqués dans le recrutement des leucocytes (par exemple, des cytokines, chimiokines et molécules d’adhésion) avec plusieurs techniques, y compris : (réaction en chaîne de polymérase quantitative en temps réel RT-qPCR), western blot, flow cytometry et adhérence des essais. Ces approches déterminer la fonction endothéliale dans le contexte inflammatoire et sont très utiles pour effectuer des tests de dépistage afin de caractériser les nouveaux régulateurs inflammatoires endothéliales qui sont potentiellement utiles pour la conception de nouvelles stratégies thérapeutiques.
Introduction
L’inflammation est une réaction biologique bénéfique contre les agents infectieux, avec l’objectif majeur d’éliminer l’agent pathogène et de réparer le tissu endommagé. Sous certaines conditions, telles que des infections chroniques ou des maladies auto-immunes, l’inflammation n’est pas résolu. Au lieu de cela, il y a une réaction aberrante avec infiltration continue des leucocytes, ce qui entraîne une réponse immunitaire prolongée qui mène à des lésions tissulaires, fibrose, perte de fonction et ensemble, handicap et dans la mort de certains cas du patient. Ces affections humaines, cataloguées comme des maladies inflammatoires, comportent tous les vaisseaux sanguins pour le contrôle de l’extravasation de leucocyte1,2.
Les cellules endothéliales jouent un rôle fondamental dans la régulation de la réponse inflammatoire en contrôlant le trafic leucocytaire. Lorsque la couche endothéliale est exposée à des médiateurs inflammatoires tels que LPS, l’endothélium de repos active et exprime des cytokines pro-inflammatoires (Cxcl10, Cxcl5, Cxcl1, etc.) et des molécules d’adhésion (E-sélectine, VCAM-1 et ICAM-1) cette faveur recrutement des leucocytes au site d’infection circulants. Les leucocytes amorcées par les cytokines libérées puis médient laminage et interaction avec la couche endothéliale par les homologues adhésifs correspondants : se-1 à la sélectine intégrine α4β1 VCAM-1 et l’intégrine αLβ2 à l’ICAM-1. Enfin, les leucocytes migrent à travers le système vasculaire vers la mise au point d’inflammation3.
Le rôle essentiel de l’endothélium dans la régulation de la réponse inflammatoire a été démontré sur des souris génétiquement modifiées pour exprimer les récepteurs LPS, récepteur toll-like 4 (TLR4), uniquement sur les cellules endothéliales. Ces animaux endothéliales TLR4 ont été en mesure de répondre à une inflammation induite par LPS et à détecter l’infection générée après l’inoculation de la bactérie et par conséquent obtenir résolution de l’infection et la survie à des niveaux semblables comme les souris de type sauvage4 , 5.
Pour la voie de la réponse inflammatoire réglementées par l’endothélium, il a été postulé que l’inhibition à certains stades de l’interaction de leucocytes-endothélium entraînerait la réduction de la migration trans-endothélial et un meilleur pronostic pour maladies inflammatoires. En fait, plusieurs stratégies ciblant l’interaction d’activation et de leucocytes-endothélium endothéliale ont été conçus pour entraver l’extravasation des cellules immunitaires comme un traitement pour troubles inflammatoires6,7.
Dans ce rapport, nous décrivons un groupe approfondi des techniques in vitro de pour caractériser complètement l’activité endothéliale en réponse aux stimulus inflammatoire LPS et son rôle dans l’activation des leucocytes et adhérence à la couche vasculaire. Le modèle de cellules endothéliales utilisé dans ce manuscrit était de la lignée de cellules endothéliales pulmonaires de souris (LTCE-04), tel que décrit par Hortelano et al. 8. the LTCE-04 la lignée cellulaire a été validée dans la littérature d’un système approprié d’étudier une activation endothéliale9,10. Basé sur les intérêts de recherche, ces approches peuvent être facilement extrapolés à toute endothéliale ou systèmes de leucocytes et profil inflammatoire. Une fois définis les paramètres endothéliales dans les conditions choisies, le système peut tester de nouveaux médicaments sur l’expérimentation proposée pour évaluer l’activation vasculaire. Dans ce contexte inflammatoire, les cellules de l’endothélium, testés avec le composé d’intérêt peuvent être comparées à des conditions de contrôle des cellules, et toute différence qui en résulte peut informer le résultat pronostique du médicament sur le développement et la progression de l’inflammation. Pour conclure, nous proposons un système pertinent afin de caractériser les nouvelles cibles de médicaments aux cellules endothéliales, qui peuvent influer sur la conception de nouvelles thérapies vasculaires spécifiques contre les maladies inflammatoires.
Protocol
Representative Results
Discussion
Ce protocole endothélial décrit une technologie progressive qui établit les bases pour explorer de nouveaux mécanismes impliqués dans la régulation de la réponse inflammatoire. Ces approches reposent sur l’étude de l’activité endothéliale stimulée par LPS et évaluer les étapes critiques impliqués dans le recrutement des leucocytes au cours de la réaction inflammatoire, plus précisément : libération de cytokines endothéliale, adhérence endothélial molécules expression et leucocytes adhérence à…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Ce travail a été soutenu par le Ministerio de Economía y Competitividad (MINECO) et l’Instituto de Salud Carlos III (ISCIII) (numéro de licence IERPY 1149/16 à L.A. ; 1410/09 MPY à S. Hortelano) ; par le MINECO via le Fondo de Investigación en Salud (FIS) (subventions numéros PI11.0036 et PI14.0055 de S. Hortelano). S. Herranz a été pris en charge par IERPY 1149/16 de ISCIII.
Materials
| Gelatin | Sigma | G9391 | |
| DMEM-F12 | Lonza | BE12-719F | |
| Fetal Bovine Serum | Sigma | A4503 | |
| Penicillin streptomycin | Lonza | DE17-602E | |
| Trypsine | Lonza | BE17-160E | |
| EDTA | Sigma | ED2SS | |
| LPS | Sigma | L2880 | |
| Trizol | Sigma | T9424 | RNA extraction buffer |
| Isopropanol | Sigma | 33539 | |
| Ethanol absoluto | Panreac | 1,310,861,612 | |
| Pure H2O | Qiagen | 1017979 | RNAse free |
| Agarose | Pronadisa | 8020 | |
| Stain for agarose gels | Invitrogen | s33102 | |
| SuperScript III First-Strand Synth | Invitrogen | 18080051 | Reagents for RT-PCR |
| Fast SYBR Green Master Mix | Applied Biosystems | 4385610 | Fluorescent stain for qPCR |
| MicroAmp Fast Optical 96-Well | Applied Biosystems | 4346906 | Plates for qPCR |
| U-bottom 96 well plates | Falcon | 353072 | |
| Cytometry tubes | Falcon | 352054 | |
| TX100 | Panreac | 212314 | Non-ionic surfactant |
| Tris-HCl | Panreac | 1,319,401,211 | |
| Sodium chloride | Merck | 1,064,041,000 | |
| Sodium pyrophosphate | Sigma | 221368 | |
| Sodium fluoride | Sigma | S7920 | |
| Sodium orthovanadate | sigma | 13721-39-6 | |
| Protease inhibitor cocktail | sigma | P8340 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Pierce | 23225 | Reagents for bicinchoninic acid assay |
| β-mercaptoethanol | merck | 805,740 | |
| PVDF Transfer Membrane, 0.45 µm | Thermo Scientific | 88518 | |
| Tween-20 | Panreac | 1,623,121,611 | Polysorbate 20 |
| PBS | Lonza | BE17-515Q | |
| ECL | Millipore | WBKLS0500 | |
| Fibronectin | Sigma | F1141 | |
| Laminin | Sigma | L2020 | |
| Collagen type I | Sigma | c8919 | |
| Acetic acid | Panreac | 1,310,081,611 | |
| Trypan blue | Sigma | T8154 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | |
| Methanol | Panreac | 1,310,911,612 | |
| Crystal violet | Sigma | HT90132 | |
| Sodium citrate | Sigma | C7254 | |
| Ethanol 96% | Panreac | 1,410,851,212 | |
| CFSE | Sigma | 21888 | |
| RPMI | Lonza | BE12-115F | |
| SDS | Bio-Rad | 161-0418 | |
| Infinite M200 | Tecan | M200 | Multi mode microplate reader |
| Gel Doc 2000 | Bio-Rad | 2000 | Gel documentation system |
| StepOnePlus | Applied Biosystems | StepOnePlus | qPCR system |
| MACSQuant Analyzer 10 | Miltenyi Biotec | Analyzer 10 | Cytometry equipment |
| ChemiDoc MP | Bio-Rad | MP | Chemiluminescence detection system |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Antibodies | |||
| PECAM-1 | BD Biosciences | 553370 | Use at 10 µg/ml |
| ICAM-2 | Biolegend | 1054602 | Use at 10 µg/ml |
| E-selectin | BD Biosciences | 553749 | Use at 10 µg/ml |
| VCAM-1 | BD Biosciences | 553330 | Use at 10 µg/ml |
| ICAM-1 | Becton Dickinson | 553250 | Use at 10 µg/ml |
| anti-rat IgG-FITC | Jackson Immuno Research | 112-095-006 | Use at 10 µg/ml |
| anti armenian hamster-FITC | Jackson Immuno Research | 127-095-160 | Use at 10 µg/ml |
| Rat IgG isotyope control | Invitrogen | 10700 | Use at 10 µg/ml |
| Armenian hamster IgG isotype control | Invitrogen | PA5-33220 | Use at 10 µg/ml |
| P-IκΒ-α | Cell Signaling | 2859 | Use at 10 µg/ml |
| β-Actin | Sigma | A5441 | Use at 10 µg/ml |
| P-ERK | Cell Signaling | 9101 | Use at 10 µg/ml |
| anti-mouse HRP | GE Healthcare | LNXA931/AE | Use at 1:10000 |
| anti-rabbit HRP | GE Healthcare | LNA934V/AG | Use at 1:10000 |
| anti-rat HRP | Santa Cruz | Sc-3823 | Use at 1:10000 |
References
- Baumgart, D. C., Sandborn, W. J. Crohn’s disease. Lancet. 380 (9853), 1590-1605 (2012).
- Skeoch, S., Bruce, I. N. Atherosclerosis in rheumatoid arthritis: is it all about inflammation?. Nat Rev Rheumatol. 11 (7), 390-400 (2015).
- Gerhardt, T., Ley, K. Monocyte trafficking across the vessel wall. Cardiovasc Res. 107 (3), 321-330 (2015).
- Andonegui, G., et al. Mice that exclusively express TLR4 on endothelial cells can efficiently clear a lethal systemic Gram-negative bacterial infection. J Clin Invest. 119 (7), 1921-1930 (2009).
- McDonald, B., Jenne, C. N., Zhuo, L., Kimata, K., Kubes, P. Kupffer cells and activation of endothelial TLR4 coordinate neutrophil adhesion within liver sinusoids during endotoxemia. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 305 (11), G797-G806 (2013).
- Pober, J. S., Sessa, W. C. Evolving functions of endothelial cells in inflammation. Nat Rev Immunol. 7 (10), 803-815 (2007).
- Chamorro, &. #. 1. 9. 3. ;., Dirnagl, U., Urra, X., Planas, A. M. Neuroprotection in acute stroke: targeting excitotoxicity, oxidative and nitrosative stress, and inflammation. Lancet Neurol. 15 (8), 869-881 (2016).
- Hortelano, S. ILK mediates LPS-induced vascular adhesion receptor expression and subsequent leucocyte trans-endothelial migration. Cardiovasc Res. 86 (2), 283-292 (2010).
- Palazón, A. Agonist anti-CD137 mAb act on tumor endothelial cells to enhance recruitment of activated T lymphocytes. Cancer Res. 71 (3), 801-811 (2011).
- Jiménez-García, L. 8,9-Dehydrohispanolone-15,16-lactol diterpene prevents LPS-triggered inflammatory responses by inhibiting endothelial activation. Biochem J. 473 (14), 2061-2071 (2016).
- . SuperScript® III First-Strand Synthesis System for RT-PCR Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/superscriptIIIfirststrand_pps.pdf (2013)
- Livak, K. J., Schmittge, T. D. Analysis of relative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2(-Delta Delta C(T)) Method. Methods. 25 (4), 402-408 (2001).
- . Pierce BCA Protein Assay Kit Available from: https://tools.thermofisher.com/content/sfs/manuals/MAN0011430_Pierce_BCA_Protein_Asy_UG.pdf (2017)
- He, F. Laemmli-SDS-PAGE. BIO-PROTOCOL. 1 (11), (2011).
- . ImageJ User Guide Available from: https://imagej.nih.gov/ij/docs/guide/user-guide-USbooklet.pdf (2017)
- Hohsfield, L. A., Humpel, C. Intravenous infusion of monocytes isolated from 2-week-old mice enhances clearance of Beta-amyloid plaques in an Alzheimer mouse model. PloS One. 10 (4), e0121930 (2015).
- Hofland, R. W., Thijsen, S. F. T., Verhagen, M. A. M. T., Schenk, Y., Bossink, A. W. J. Tuberculosis during TNF-α inhibitor therapy, despite screening. Thorax. 68 (11), 1079-1080 (2013).
- Ley, K., Laudanna, C., Cybulsky, M. I., Nourshargh, S. Getting to the site of inflammation: the leukocyte adhesion cascade updated. Nat Rev Immunol. 7 (9), 678-689 (2007).
- Tedgui, A., Mallat, Z. Anti-inflammatory mechanisms in the vascular wall. Circ Res. 88 (9), 877-887 (2001).
- Zheng, Y., Humphry, M., Maguire, J. J., Bennett, M. R., Clarke, M. C. H. Intracellular interleukin-1 receptor 2 binding prevents cleavage and activity of interleukin-1α, controlling necrosis-induced sterile inflammation. Immunity. 38 (2), 285-295 (2013).
- Pripp, A. H., Stanišić, M. The correlation between pro- and anti-inflammatory cytokines in chronic subdural hematoma patients assessed with factor analysis. PloS One. 9 (2), e90149 (2014).
- Guha, M., Mackman, N. LPS induction of gene expression in human monocytes. Cell Signal. 13 (2), 85-94 (2001).
- Tabas, I., Glass, C. K. Anti-inflammatory therapy in chronic disease: challenges and opportunities. Science. 339 (6116), 166-172 (2013).
