Visualização do Padrão de Projeção Axonal de Neurônios de Motor Embrionários em<em> Drosophila</em

Summary

Este trabalho detalha um método de imuno-histoquímica padrão para visualizar as projeções de neurônios motores de embriões de Drosophila melanogaster em estágio final 16. A preparação em fileira de embriões fixos corados com anticorpo FasII fornece uma ferramenta poderosa para caracterizar os genes necessários para a identificação do axônio do motor e o reconhecimento do alvo durante o desenvolvimento neural.

Abstract

O estabelecimento de circuitos neuromusculares funcionais depende de conexões precisas entre desenvolvimento de axônios motores e músculos alvo. Os neurônios motores estendem os cones de crescimento para navegar por caminhos específicos, respondendo a uma grande quantidade de pistas de orientação axônica que emanam do ambiente extracelular circundante. O reconhecimento do alvo do cone de crescimento também desempenha um papel crítico na especificidade neuromuscular. Este trabalho apresenta um protocolo de imuno-histoquímica padrão para visualizar as projeções de neurônios motores de embriões de Drosophila melanogaster em estágio final 16. Este protocolo inclui algumas etapas importantes, incluindo um procedimento de genotipagem, para classificar os embriões mutantes desejados; Um procedimento de imunomarquação, para marcar embriões com anticorpo fasciclin II (FasII); E um procedimento de dissecação, para gerar preparações em filetes a partir de embriões fixos. As projeções do axônio do motor e os padrões musculares na periferia são muito melhor visualizados em preparações planas de embriões em filetes do que em whEmbriões de montagem clara. Portanto, a preparação em fileira de embriões fixos corados com anticorpo FasII fornece uma ferramenta poderosa para caracterizar os genes necessários para a identificação do mecanismo axonal do motor e o reconhecimento do alvo, e também pode ser aplicado tanto às telas genéticas de perda de função como de ganho de função .

Introduction

As conexões precisas e seletivas entre axônios motores e músculos alvo durante o desenvolvimento embrionário são essenciais para a locomoção normal em larvas de Drosophila . O padrão embrionário de 30 fibras musculares em cada um dos hemisegmentos abdominais A2-A7 é estabelecido pelo estágio 16 ¹ . Os 36 neurônios motores que são gerados no nervo ventral prolongam seus axônios na periferia para inervar os músculos alvo específicos ² . A identificação do mecanismo axonal do motor e o reconhecimento do alvo podem ser visualizados por imuno-histoquímica com um anticorpo (anticorpo monoclonal de mouse 1D4) ^{3 , 4} . Múltiplas imagens dos padrões de projeção do axônio do motor em embriões de tipo selvagem estão disponíveis na web ⁵ . O anticorpo 1D4 rotula todos os axônios motores e três fascículos do axônio longitudinal em cada lado da linha mediana do sistema nervoso central embrionário (SNC) ⁴ </sUp> ^{, 6} ( Figura 1C e Figura 2A ). Portanto, a imuno-histoquímica com anticorpo FasII fornece uma poderosa ferramenta para identificar os genes necessários para a conectividade neuromuscular para demonstrar mecanismos moleculares subjacentes à orientação do axônio motor e ao reconhecimento do alvo.

Em cada um dos hemisegamentos abdominais A2-A7, os axônios motores projetam e se fasciculam seletivamente em dois ramos nervosos principais, o nervo segmentar (SN) e o nervo intersegmental (ISN) ^{2 , 4} e um ramo nervoso menor, o nervo transversal (TN ) ⁷ . O SN seletivamente defascicula para dar origem a dois ramos do nervo chamados SNa e SNc, enquanto a ISN se divide em três ramos do nervo chamado ISN, ISNb e ISNd ^{2 , 4} . Entre eles, o ISN do motor ISN, ISNb e SNaOs padrões de projeção são visualizados de forma mais precisa quando os embriões do estágio final 16 são corados com anticorpo FasII e são fileados ( Figura 1C e Figura 2A ). Os neurônios motores ISN estendem seus axônios para inervar os músculos dorsais 1, 2, 3, 4, 9, 10, 11, 18, 19 e 20 ^{2 , 4} ( Figura 2A ). Os neurônios motores ISNb inervam os músculos ventrolatares 6, 7, 12, 13, 14, 28 e 30 ^{2 , 4} ( Figura 2A e 2B). O ramo do nervo SNa projeta para inervar os músculos laterais laterais 5, 8, 21, 22, 23 e 24 ^{2 , 4} ( Figura 2A ). O TN, que consiste em dois axônios motores, projeta-se ipsilateralmente ao longo da borda segmentar para inervar o músculo 25 e faz sinapses com o neurônio dendrítico bipolar lateral (LBD) noPeriferia ⁷ ( Figura 2A ). Essas inervações musculares alvo exigem não apenas a defasciculação seletiva de axônios motores em pontos de escolha específicos, mas também o reconhecimento muscular alvo. Além disso, algumas células putativas mesposéricas de guia que atuam como objetivos intermediários foram encontradas nas vias ISN e SNa, mas não ao longo da via ISNb ⁴ . Isso pode sugerir que a direção do axônio do motor ISNb pode ser regulada de forma distinta em relação à orientação do axônio do motor ISN e SNa, e também indica que a orientação axônica do motor periférico fornece um modelo experimental atraente para estudar os papéis diferenciais ou conservados de uma única guia de orientação Molécula ⁸ .

Este trabalho apresenta um método padrão para visualizar os padrões de projeção axonal de neurônios motores embrionários em Drosophila . Os protocolos descritos incluem como dissecar embriões fixos corados com 1D4 aNitido e processado em 3,3'-diaminobenzidina (DAB) para preparações em filetes. Uma vantagem crítica das preparações planas de embriões fixos é a melhor visualização das projeções axonais e dos padrões musculares na periferia. Além disso, este trabalho também mostra como genótipos embriões fixos para classificar os embriões mutantes desejados usando o método de coloração LacZ.

Protocol

1. Preparação Preparar 500 mL de solução salina tamponada com fosfato (PBS) com solução de t-octilfenoxipoletoxietanol (PBT) adicionando 0,5 g de albumina de soro bovino (BSA) e 0,5 mL de t-octilfenoxipoletoxietanol (ver Tabela de Materiais) a 500 mL de PBS 1X E mexendo durante pelo menos 30 min. Armazenar a 4 ° C. Use quando relativamente fresco e guarde a solução em uma garrafa limpa. Faça 10 mL de paraformaldeído a 4% adicionando 2,5 mL de solução de paraformaldeído em estoque a 16%…

Representative Results

As conexões precisas entre axônios motores e músculos alvo durante o desenvolvimento neural dependem da repulsão axônica-axônica seletiva e do reconhecimento de alvo em pontos de escolha específicos 4 . Em Drosophila , a repulsão seletiva entre axônios motores é em parte regulada pela ação combinada de semaforinas de classe 1 e 2 (Semas), incluindo Sema-1a, Sema-2a e Sema-2b 8 , 14 <su…

Discussion

Os detalhes dos defeitos de orientação do axônio do motor são mais rápidos e com melhor precisão pela preparação em filetes de embriões corados com DAB do que por microscopia confocal de varredura laser de marcadores fluorescentes. Portanto, a preparação em fileira de embriões corados fixos e 1D4 é mais adequada para a caracterização funcional de moléculas de orientação. Quatro principais classes de dicas de orientação, incluindo netrins, Slits, semaforas (Semas) e ephrins, e seus receptores cognatos…

Materials

Bovine Serum Albumin	Sigma-Aldrich	A7906
Triton X-100	Sigma-Aldrich	X100	t-Octylphenoxypolyethoxyethanol
16% Paraformaldehyde Solution	Ted Pella	18505
Sodium Chloride	Sigma-Aldrich	S5886
Potassium Chloride	Sigma-Aldrich	P5405
Sodium Phosphate Dibasic	Sigma-Aldrich	30435
Sodium Phosphate Monobasic	Sigma-Aldrich	71500
X-Gal Substrate	US Biological	X1000	X-Gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactoside galactopyranoside)
Dimethyl Sulfxide	Sigma-Aldrich	D4540
Magnesium Chloride	Sigma-Aldrich	M8266
Potassium hexacyanoferrate(II) trihydrate	Sigma-Aldrich	P9387
Potassium hexacyanoferrate(III)	Sigma-Aldrich	244023
Hydrogen Peroxide	Sigma-Aldrich	216763
3,3'-diaminobenzidine Tetrahydrochloride	Sigma-Aldrich	D5905
Agar	US Biological	A0930
Sucrose	Fisher Scientific	S5-3
Tegosept (Methy 4-Hydroxybenzoate)	Sigma-Aldrich	H5501
Culture Dish (60 mm)	Corning	430166
Tricon Beaker	Simport	B700-100	This is used to make a plastic beaker cage for embryo collection.
Yeast	Societe Industrielle Lesaffre	Saf Instant Yeast Red
Cotton Swab (Wooden Single Tip Cotton PK100)	VWR	14220-263
Eppendorf Tube (1.5 ml)	Sarstedt	#72.690
Bleach	The Clorox Company	Clorox
Heptane	Sigma-Aldrich	246654
Methanol	J.T. Baker	UN1230
Normal Goat Serum	Life Technologies	16210-064
Anti-FasciculinII Antibody	Developmental Studies Hybridoma Bank	1D4 anti-Fasciclin II
Goat Anti-mouse-HRP Antibody	Jackson Immunoresearch	115-006-068	AffiniPure F(ab')2 Fragment Goat Anti-Mouse IgG+IgM (H+L) (min X Hu, Bov, Hrs Sr Prot
Glycerol	Sigma-Aldrich	G9012
Slide Glass	Duran Group	235501403
Coverslip	Duran Group	235503104	18 x 18 mm
1 ml Syringe	Becton Dickinson Medical(s)	301321
Tungsten Needle	Ted Pella	#27-11	Tungsten Wire, ø0.13mm/6.1m (ø.005"/20 ft.)
Nutator (Mini twister)	Korean Science	KO.VS-96TWS	Alternatively, BD Clay Adams Brand Nutator (BD 421125)