В пробирке Assay биолюминесценции характеризовать Циркадный ритм в эпителиальных клеток молочной железы
Summary
Представлен в vitro assay биолюминесценции для определения сотовой Циркадный ритм в эпителиальных клетках молочной железы. Этот метод использует mammalian клетки репортер плазмид, выражая дестабилизировали Люцифераза под контролем промотора гена период 2 . Она может быть адаптирована для других типов клеток, оценить эффекты органоспецифическая на суточный ритм.
Abstract
Циркадный ритм процесс основных физиологических настоящее во всех организмах что регулирует биологические процессы, начиная от экспрессии генов спать поведение. В позвоночных суточный ритм контролируется молекулярной осциллятор, который функционирует как Супрахиазмальное ядро (SCN; Центральная кардиостимулятора), так и отдельных ячеек, состоящий из наиболее периферических тканей. Что еще более важно нарушения циркадного ритма воздействием света ночью, экологических стрессоров или ядовитых веществ связаны с повышенным риском хронических заболеваний и старения. Способность определить агенты, которые могут нарушить Центральной или периферической биологические часы и агенты, которые могут предотвратить или смягчить последствия нарушения циркадного, имеет существенные последствия для профилактики хронических заболеваний. Хотя грызунов модели могут использоваться для определения воздействия и агентов, которые вызывают или предотвращения и смягчения суточного нарушения, эти эксперименты требуют большого количества животных. В vivo исследования также требуют наличия значительных ресурсов и инфраструктуры и исследователей работать всю ночь. Таким образом существует настоятельная необходимость для камерного типа соответствующие в vitro системы экран для окружающей среды суточного разрушители и усилители в типах клеток от болезни государств и различных органов. Мы построили вектор, диски транскрипции дестабилизировали Люцифераза в эукариотических клетках под контролем промотора гена человека период 2 . Эта конструкция суточного репортер был стабильно transfected в человеческих эпителиальных клеток молочной железы, и суточного реагировать репортер клетки были отобраны развивать пробирного биолюминесценции в пробирке . Здесь мы представляем подробный протокол для создания и проверки assay. Далее мы подробно для доказательства концепции экспериментов, демонстрирующих способность нашего анализа в vitro пилки в vivo воздействию различных химических веществ на клеточном биологические часы. Результаты показывают, что assay может быть адаптирована для различных типов клеток для окружающей среды разрушители и заметкой усилители суточного часов.
Introduction
Суточный часов регулирует широкий круг биологических процессов от суточного экспрессии генов спать поведение в предсказуемый ритм с периодичностью около 24 ч. эпидемиологические исследования показывают, сильно, что хроническое нарушение суточного ритм увеличивает риск рака груди и рака простаты в сдвиг рабочих, включая медсестер и рейс экипажей1,2,3. Эти выводы подтверждаются грызунов исследования, демонстрируя что подверженность постоянный свет, свет ночью, или света циклов, которые имитируют биоритмов увеличение распространенности опухоли и ускоряет рост опухоли4,5. Основываясь на данных исследований, как людских, так и грызунов, международное агентство по изучению рака классифицируются посменной работы как вероятный канцероген человека (тип 2A) в 20106.
Ранее мы показали, что канцерогенные однократным введением конкретных канцерогенов молочной железы опухоль, N– нитрозосоединения-N– methylurea (НГУ), нарушается суточного выражение основных суточного генов (СГС) (например, период 2 , Per2) и несколько суточного контролируемой генов (CCGs), включая основные повреждения ДНК реагировать и ремонт генов (РДРР) в целевой молочной железы (но не в печени). Кроме того, Сброс суточного выражение генов Per2 и РДРР к нормальной с заметкой режим питания L-метил-Селеноцистеин (MSC) снижению заболеваемости опухоли на 63%. Эти выводы были первыми, чтобы показать механистический связь между Циркадный ритм, химического канцерогенеза и химиопрофилактики7,8. Воздействия других экологических токсикантов, показано сорвать суточного ген выражение в естественных условиях , также связаны с повышенным риском экологических болезней9,10. Понимание механизмов, которые связывают суточного нарушения экологических токсикантов и патогенез может привести к механически-подходов к профилактике заболеваний. Однако, исследования, направленные на определение взаимодействий между воздействия и суточный ритм обычно выполняются в vivo. Типичная в естественных условиях эксперимента расследование влияние на суточный ритм требует большого количества животных, как контролировать тканей из по меньшей мере три и три подвергаются животные должны быть собраны каждые 3-4 ч в течение 24 или 48 часов. Разработка проверенных в vitro системы, которая резюмирует наблюдений в естественных условиях и механизмов будет поэтому не только уменьшить количество животных, необходимых, но также значительно сократить расходы на экспериментальной и требование, Исследователи работают непрерывно в течение 24-48 ч. Кроме того проверенных в vitro система может использоваться для проверки высокой пропускной способности соединений и/или генетические изменения, которые влияют на суточный ритм, или его ответ на экологических стрессоров или ядовитых веществ. Поэтому стратегическое сочетание in vitro и in vivo моделей и экспериментов необходимы для получения различных идеи с другой фокус.
В млекопитающих суточного осцилляторов существуют не только в специализированных нейронов ППП, но и в самые периферийные типы клеток. Эти молекулярные часы аналогичны в установленных фибробластов клеточных линий и в первичной фибробласты из зародышей или взрослых животных; Однако есть потребность тканей конкретного типа сотовой модели11. Следовательно традиционные исследования двигательной активности в естественных условиях, SCN эксплантах ex vivo, и на основе ячеек в vitro анализов в увековечен фибробластов клетки широко используются для изучения клеток автономная суточного дефектов. Однако нет никаких свидетельств, указывающих, что в vitro фибробластов на основе ячеек assay может резюмировать суточного механизмов и ответы присутствует в клетках других периферийных органов в естественных условиях. Различных типов клеток могут иметь различные шаблоны экспрессии генов, метаболизма ксенобиотиков и РДРР, и связей между токсичности и суточного ген выражение может быть типа клеток специфического и/или модулированный в различных физиологических параметров. Кроме того суточного осцилляторов в системах на базе фибробластов еще не были полностью оценены для ответов на экологических токсикантов, стресс и превентивной агентов, которые связывают воздействия механизмы развития заболевания и профилактика. Таким образом существует необходимость для конкретных снисходительный, одобренного типа клеток, в пробирке биолюминесценции анализов для изучения конкретных экологических суточного Разрушители орган. Хотя целый ряд моделей сотовых будильник (например, в печени, кератиноциты и жировых клеток, а также линия клетки остеосаркома) были разработаны в последние годы12,13,14, 15, проба, описанные здесь это первая модель сотовой будильник в эпителиальных клеток молочной железы и первой демонстрации резюмировать в vivo ответы на экологических стрессоров, ядовитых веществ, наркотиков и заметкой агентов.
Renilla Люцифераза (rLuc) и Светлячок Люцифераза являются 30-61 кДа мономерных белков, которые не требуют Посттрансляционная обработки для ферментативной активности и может функционировать в качестве репортера генетических сразу же после перевода. После того, как субстрат связывает с Люцифераза фермента, биохимические реакции катализированные генерирует вспышка света. Таким образом Люцифераза конструкции широко используются как ген выражение репортер системы в пробирке и в естественных условиях. Однако, в исследованиях Циркадный ритм, Утилита Люцифераза репортер ограничивается относительно долгий период полураспада Люцифераза белка (T1/2 = 3,68 h) по сравнению с периодом (особенно в короткий период) для изменения в суточный гена выражение; Однако многочисленные исследования с годами успешно использовали Люцифераза гена в pGL3 вектор, указывающий, что быстро разлагаются Люцифераза не может быть необходимым для отчетности циркадные ритмы, особенно для ритмы с более длительного периода, такие как 24 ч. Поэтому репортер плазмида с использованием вектора дестабилизировали Люцифераза, pGL [Luc2P/Neo], который содержит hPEST (последовательность дестабилизации белка) был разработан, позволяя нам использовать его как вектор суточного репортер для наших текущих в пробирке пробирного биолюминесценции. Белков, кодируемых Luc2P имеет более короткий период полураспада (T1/2 = 0,84 h) и следовательно, реагирует быстрее и с большей величины изменения в транскрипционный анализ активности, чем одичал тип, яndicating, что он может быть использован для мониторинга ритмические выражения Люцифераза, регулируется PER2 промоутер точно в режиме реального времени16.
Protocol
Representative Results
Discussion
В клетках млекопитающих периодичности суточного часов регулируется взаимосвязанных транскрипционный анализ/трансляционная обратной связи. Гетеродимерами Bmal1 и часы или Npas2 регулирования суточного транскрипции путем привязки к элементам E-бокс в промоутеров ядра СГС, включая Per2 …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа была поддержана 2012 общество токсикологии (ГНС)-компании Colgate Palmolive Грант для укрепляющий исследований (м. клык) и исследования международного сотрудничества Фонда животных и растений карантина агентства, Республика Корея (м. клык), и Грант NIEHS P30ES005022 (H. Zarbl). Мы хотели бы поблагодарить д-ра Чжэн Чэнь (Макговерн медицинская школа при университете центра науки здоровья Техас в Хьюстон) за его полезные обсуждения, г-н Хуан Shao-An для его экспериментальной помощи и г-жа Кими наката для ее доказательство чтения.
Materials
| pLS[hPER2P/rLuc/Puro] vector | SwitchGear Genomics | S700000 | customized vector |
| pGL4.18[Luc2P/Neo] vector | Promega | 9PIE673 | destabilized luciferase expression vector |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224041 | For subcloning |
| TOPO TA cloning kit | Invitrogen | K4500-02 | with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli |
| Sac I | New England BioLabs | R0156S | Restriction enzyme |
| Hind III-HF | New England BioLabs | R3104S | Restriction enzyme |
| CutSmart buffer | New England BioLabs | B7204S | Restriction enzyme buffer |
| DNA gel extraction kit | Qiagen | 28704 | Purify DNA fragments from agarose gel |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | DNA clean up |
| LB Miller's modification | TEKNOVA | L8600 | For transformed E. Coli culture |
| LB Agar Plate | TEKNOVA | L1902 | For white/blue selection |
| QIAprep spin miniprep Kit | Qiagen | 27104 | For extraction of plasmide DNA |
| EndoFree plasmid maxi prep Kit | Qiagen | 12362 | For extraction of plasmide DNA |
| FuGene HD | Promega | E2311 | Transfection reagent |
| Opti-MEM reduced serum medium | Invitrogen | 31985-062 | For transfection |
| MCF10A cell line | American Type Culture Collection | CRL-10317 | Mammary Epithelial Cells |
| MEGM BulletKit | Lonza | CC-3150 | Mammary Epithelial Growth Medium |
| MEBM | Lonza | CC-3151 | Mammary Epithelial Basal Medium |
| MEGM SingleQuot Kit | Lonza | CC-4136 | Suppliments & Growth Factors |
| ReagentPack | Lonza | CC-5034 | Reagent for subculture |
| D-PBS (10X) | Sigma | D1408 | Wash cells in culture dishes |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen | 10977 | Dilute 10X D-PBS |
| Tissue culture dish (35 mm) | BD/Falcon | 353001 | cell culture dish suitable to LumiCycle |
| Silicon grease | Fisher | NC9044707 | For sealing dish with recording medium |
| Round cover glass | Harvard Bioscience | 64-1500 (CS-40R) | For sealing dish with recording medium |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Supplement for growth medium |
| G418 sulfate (Geniticin) | Invitrogen | 10131035 | Antibiotic for selection of stabliy transfected cells |
| Ampicillin | Sigma | A9393 | For colony selection |
| Forskolin | Sigma | F6886 | Synchronization agent |
| Melatonin | Sigma | M5250 | Synchronization agent |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Synchronization agent |
| Horse serum | Sigma | H1138 | Synchronization agent |
| d-Luciferin, sodium salt | Invitrogen | L2912 | Luciferase substrate |
| IC261 | Sigma | 10658 | Positive control for circadian disruptor |
| Methylnitrosourea (NMU) | Sigma | N1517 | Mammary specific carcinogen |
| Methylselenocysteine (MSC) | Sigma | M6680 | Organic selenium (chemopreventive agent) |
| EX527 | Sigma | E7034 | SIRT1 specific inhibitor |
| Cambinol | Sigma | C0494 | SIRT1 & SIRT2 inhibitor |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 8000 | Quantify nucleotide |
| GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | N805-0200 | For molecular biology experiment |
| CO2 Incubator | NAPCO | Series 8000 DH | For cell culture at 5% CO2 at 37 °C |
| Desktop centrifuge with refrezerator | Eppendorf | 5430R | For molecular biology experiment |
| Centrifuge with swing bucket | Eppendorf | 5810 R | For cell culture |
| Inverted microscope | Nikon | 80124 | Phase contrast optional |
| Tissue culture hood | Labconco | Class II A2 | BSL-2 certified |
| LumiCycle 32 | Actimetrics | Not Available | Luminoscence detector |
References
- Akerstedt, T., et al. Night work and breast cancer in women: a Swedish cohort study. BMJ Open. 5 (4), e008127 (2015).
- Parent, M. E., El-Zein, M., Rousseau, M. C., Pintos, J., Siemiatycki, J. Night work and the risk of cancer among men. Am J Epidemiol. 176 (9), 751-759 (2012).
- Knutsson, A., et al. Breast cancer among shift workers: results of the WOLF longitudinal cohort study. Scand J Work Environ Health. 39 (2), 170-177 (2013).
- Fu, L., Lee, C. C. The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor. Nat Rev Cancer. 3 (5), 350-361 (2003).
- Fu, L., Kettner, N. M. The circadian clock in cancer development and therapy. Prog Mol Biol Transl Sci. 119, 221-282 (2013).
- IARC. Painting, Firefighting, and Shiftwork. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. 98, 563-764 (2010).
- Zhang, X., Zarbl, H. Chemopreventive doses of methylselenocysteine alter circadian rhythm in rat mammary tissue. Cancer Prev Res (Phila Pa). 1 (2), 119-127 (2008).
- Fang, M. Z., Zhang, X., Zarbl, H. Methylselenocysteine resets the rhythmic expression of circadian and growth-regulatory genes disrupted by nitrosomethylurea in vivo. Cancer Prev Res (Phila). 3 (5), 640-652 (2010).
- Burbulla, L. F., Kruger, R. Converging environmental and genetic pathways in the pathogenesis of Parkinson’s disease. J Neurol Sci. 306 (1-2), 1-8 (2011).
- Aitlhadj, L., Avila, D. S., Benedetto, A., Aschner, M., Sturzenbaum, S. R. Environmental exposure, obesity, and Parkinson’s disease: lessons from fat and old worms. Environ Health Perspect. 119 (1), 20-28 (2011).
- Nagoshi, E., Brown, S. A., Dibner, C., Kornmann, B., Schibler, U. Circadian gene expression in cultured cells. Methods Enzymol. 393, 543-557 (2005).
- Ramanathan, C., et al. Cell type-specific functions of period genes revealed by novel adipocyte and hepatocyte circadian clock models. PLoS Genet. 10 (4), e1004244 (2014).
- Sporl, F., et al. A circadian clock in HaCaT keratinocytes. J Invest Dermatol. 131 (2), 338-348 (2011).
- Zhang, E. E., et al. A genome-wide RNAi screen for modifiers of the circadian clock in human cells. Cell. 139 (1), 199-210 (2009).
- Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (15), 5339-5346 (2004).
- Leclerc, G. M., Boockfor, F. R., Faught, W. J., Frawley, L. S. Development of a destabilized firefly luciferase enzyme for measurement of gene expression. Biotechniques. 29 (3), (2000).
- Genomics, S. . Technical Note: SwitchGear methods for gene model construction and transcription start site prediction. , (2009).
- Scientific, F. . Safety Data Sheet: Ethidium bromide, 1% Solution/Molecular Biology. , (2010).
- Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1994).
- Yoo, S. H., et al. A noncanonical E-box enhancer drives mouse Period2 circadian oscillations in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2608-2613 (2005).
- Chen, Z., et al. Identification of diverse modulators of central and peripheral circadian clocks by high-throughput chemical screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (1), 101-106 (2012).
- Fang, M., Guo, W. R., Park, Y., Kang, H. G., Zarbl, H. Enhancement of NAD+-dependent SIRT1 deacetylase activity by methylselenocysteine resets the circadian clock in carcinogen-treated mammary epithelial cells. Oncotarget. , (2015).
- Chen-Goodspeed, M., Lee, C. C. Tumor suppression and circadian function. J Biol Rhythms. 22 (4), 291-298 (2007).
- Balsalobre, A. Clock genes in mammalian peripheral tissues. Cell Tissue Res. 309 (1), 193-199 (2002).
- Jung-Hynes, B., Huang, W., Reiter, R. J., Ahmad, N. Melatonin resynchronizes dysregulated circadian rhythm circuitry in human prostate cancer cells. J Pineal Res. 49 (1), 60-68 (2010).
- von Gall, C., et al. Melatonin plays a crucial role in the regulation of rhythmic clock gene expression in the mouse pars tuberalis. Ann N Y Acad Sci. 1040, 508-511 (2005).
- Vujovic, N., Davidson, A. J., Menaker, M. Sympathetic input modulates, but does not determine, phase of peripheral circadian oscillators. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 295 (1), R355-R360 (2008).
- Schofl, C., Becker, C., Prank, K., von zur Muhlen, A., Brabant, G. Twenty-four-hour rhythms of plasma catecholamines and their relation to cardiovascular parameters in healthy young men. Eur J Endocrinol. 137 (6), 675-683 (1997).
- Yu, H., et al. Circadian rhythm of circulating fibroblast growth factor 21 is related to diurnal changes in fatty acids in humans. Clin Chem. 57 (5), 691-700 (2011).
- Nakagawa, H., et al. Modulation of circadian rhythm of DNA synthesis in tumor cells by inhibiting platelet-derived growth factor signaling. J Pharmacol Sci. 107 (4), 401-407 (2008).
- Yang, X., Guo, M., Wan, Y. J. Deregulation of growth factor, circadian clock, and cell cycle signaling in regenerating hepatocyte RXRalpha-deficient mouse livers. Am J Pathol. 176 (2), 733-743 (2010).
- Virag, L. Structure and function of poly(ADP-ribose) polymerase-1: role in oxidative stress-related pathologies. Curr Vasc Pharmacol. 3 (3), 209-214 (2005).
- Kon, N., Sugiyama, Y., Yoshitane, H., Kameshita, I., Fukada, Y. Cell-based inhibitor screening identifies multiple protein kinases important for circadian clock oscillations. Commun Integr Biol. 8 (4), e982405 (2015).
- Ramanathan, C., Khan, S. K., Kathale, N. D., Xu, H., Liu, A. C. Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters. J Vis Exp. (67), e4234 (2012).
- Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Curr Biol. 14 (24), 2289-2295 (2004).
