Vitro Sirkadiyen ritim meme epitel hücreleri ayırdetmek için bioluminescence tahlil
Summary
Hücresel sirkadiyen ritim meme epitel hücreleri belirlemek için bir vitro bioluminescence tahlil sunulur. Bu yöntem memeli hücre muhabir plazmid istikrarsızlığın luciferase dönem 2 gen düzenleyici denetimi altında ifade kullanır. Sirkadiyen ritim organ özgü etkileri değerlendirmek için diğer hücre tipleri için uyarlanabilir.
Abstract
Sirkadiyen ritim biyolojik süreçlerin davranış uyumaya gen ifadeden değişen düzenleyen bir temel fizyolojik tüm canlılar arasında mevcut bir süreçtir. Omurgalılar, sirkadiyen ritim fonksiyonları hem suprachiasmatic çekirdeği (SCN; Merkezi kalp pili) ve tek tek hücreler en periferik dokularda oluşan bir moleküler osilatör tarafından kontrol edilir. Daha da önemlisi, sirkadiyen ritim ışık gece, çevresel stres ve/veya toxicants maruz bozulma yaşlanma ve kronik hastalıkların riski ile ilişkilidir. Merkezi ve/veya periferik biyolojik saatler bozabilir ajanlar ve önlemek veya sirkadiyen bozulma, etkilerini azaltmak aracıları tanımlama yeteneği kronik hastalıkların önlenmesi için önemli sonuçları vardır. Kemirgen modelleri Etkilenmeler ve teşvik veya sirkadiyen kesintileri önlemek/azaltmak aracıları tanımlamak için kullanılan rağmen bu deneylerin hayvanlar çok sayıda gerekir. İn vivo çalışmalar da önemli miktarda kaynak ve altyapı çalıştırmaları ve araştırmacılar bütün gece çalışmak gerekir. Böylece, işte bir hücre tipi uygun vitro sistemi için acil bir ihtiyaç için çevre sirkadiyen olduk ve hücre tipleri arttırıcılar ekran farklı organ ve hastalık durumlarında. Biz insan dönemi 2 gen düzenleyici denetimi altında ökaryotik hücrelerde bozulma luciferase, transkripsiyon sürücüler bir vektör inşa. Bu sirkadiyen muhabir yapıyı stabil insan meme epitel hücreleri transfected ve sirkadiyen duyarlı muhabiri hücre vitro bioluminescence testi geliştirmek üzere seçildi. Burada, kurmak ve tahlil doğrulamak için detaylı bir iletişim kuralı mevcut. Daha fazla kanıt-in vivo etkileri çeşitli kimyasallar hücresel biyolojik saat özetlemek için bizim vitro tahlil yeteneği gösteren kavram deneyler için ayrıntıları sağlar. Sonuçlar tahlil çeşitli hücre tiplerinin çevresel olduk ve chemopreventive arttırıcılar sirkadiyen saatler için ekran için adapte edilebilir gösterir.
Introduction
Sirkadiyen saat geniş bir düzenleyen davranış tahmin edilebilir bir ritim içinde yaklaşık 24 h Epidemiological bir periodicity ile uyku genlerin diurnal ifadeden biyolojik süreçlerin çalışmalar güçlü sirkadiyen kronik bu bozulma önermek ritim meme ve shift işçiler, hemşireler ve uçuş ekipleri1,2,3gibi prostat kanseri riskini artırır. Bu bulgular kemirgen çalışmaları, jet-lag artış tümörü insidansı taklit ve tümör büyüme4,5hızlandırır sabit ışık, ışık gece veya hafif döngüleri için bu maruz kalma gösteren tarafından doğrulanmıştır. İnsan ve kemirgen çalışmaları gelen verileri esas, Uluslararası Ajansı kanser araştırma için vardiyalı çalışma muhtemel insan kanseri (tip 2A) 20106olarak sınıflandırılmış.
Daha önce biz bu gösterdi meme tümör belirli kanserojen, N– nitrozo kanserojen bir tek doz-N– methylurea (NMU), bozulmuş sirkadiyen ifade büyük sirkadiyen genlerin (CGs) (örneğin, dönem 2 , Per2) ve dahil olmak üzere birkaç sirkadiyen kontrollü genler (CCGs), anahtar DNA hasarı duyarlı ve onarım (DDRR) genleri hedef meme bezi (Ama karaciğer içinde). Ayrıca, diyet Lchemopreventive bir rejimi tarafından normal doğru Per2 ve DDRR genlerin sirkadiyen ifade sıfırlama-metil-selenocysteine (MSC) %63 tümörü insidansı azaldı. Bu bulgular sirkadiyen ritim, kimyasal karsinojenezis ve chemoprevention7,8arasında mekanik bir bağlantı göstermek için ilk idi. Etkilenmeler sirkadiyen gen ifade içinde vivo bozmaya gösterilen diğer çevresel toxicants için Ayrıca çevresel hastalıklar9,10riski ile ilişkilidir. Çevre toxicants ve Patogenez sirkadiyen bozulma bağlantı mekanizmaları anlama mechanistically tabanlı yaklaşımlar hastalık önleme neden olabilir. Ancak, çalışmalar yönelik pozlama arasındaki etkileşimler tanımlama ve sirkadiyen ritim genellikle yapılan içinde vivo. Sirkadiyen ritim etkisi en az üç dokulardan kontrol ve üç maruz kalan hayvan olması gerekir gibi hayvanlar, çok sayıda gerektirir araştıran bir tipik vivo içinde deneme her 3-4 h 24 veya 48 s süre içinde toplanır. Vivo gözlemler ve mekanizmaları beyannamedir doğrulanmış vitro sisteminin geliştirilmesi bu nedenle sadece hayvanların gerekli sayıda azaltmak ama aynı zamanda önemli ölçüde deneysel maliyeti ve gereksinimi azaltmak bu araştırmacılar sürekli olarak 24-48 h bir süre içinde iş. Ayrıca, bir doğrulanmış vitro sistem yüksek üretilen iş bileşikler ve/veya sirkadiyen ritim veya çevresel stres veya toxicants onun yanıtı etkileyen genetik değişiklik ile taranması için kullanılabilir. Bu nedenle, vitro ve in vivo modeller ve deneyler stratejik kombinasyonu ile farklı odak farklı anlayışlar elde etmek için gereklidir.
Memelilerde, sirkadiyen osilatörler SCN özel nöronlar sadece, aynı zamanda en periferik hücre tipleri içinde mevcut. Bu moleküler saatleri embriyo veya yetişkin hayvanlar kurulan fibroblast hücre satırları ve birincil fibroblastlar benzer; Ancak, doku türüne özgü hücresel modelleri11için bir ihtiyaç vardır. Sonuç olarak, geleneksel Lokomotor aktivite içinde vivo, SCN (sahne) çalışmaların ex vivoexplants ve hücre tabanlı vitro deneyleri ölümsüzleştirdi fibroblast hücrelerinde yaygın olarak hücre özerk sirkadiyen hataları incelemek için kullanılır. Ancak, bir vitro fibroblast hücre tabanlı tahlil sirkadiyen mekanizmaları özetlemek gösteren hiçbir kanıt yoktur ve yanıt-e doğru diğer çevre organlara vivo içindehücrelerinde mevcut. Farklı hücre tipleri farklı desenler gen ekspresyonu, xenobiotic metabolizma ve DDRR sahip olabilir ve toksisite ve sirkadiyen gen ekspresyonu arasında bağlantılar hücre tipi olabilir belirli ve/veya farklı fizyolojik parametreler tarafından modüle edilmiş. Buna ek olarak, fibroblast tabanlı sistemlerde sirkadiyen osilatörler tam yanıt çevre toxicants, stres ve Etkilenmeler hastalığı geliştirme ve Önleme mekanizmaları için bağlantı koruyucu ajanlar için değerlendirdikten değil. Böylece, facile, doğrulanmış hücre türü özel, vitro bioluminescence deneyleri organ belirli çevre sirkadiyen bozucular çalışmaya ihtiyaç vardır. Hücresel saat modelleri (örneğin, karaciğer, keratinositler ve yağ hücrelerinin yanı sıra bir osteosarkom hücre kültürünü) çeşitli olmasına rağmen son yıllarda12,13,14‘ te, geliştirilmiştir 15, burada açıklanan tahlil ilk hücresel saat meme epitel hücreleri ve in vivo yanıt çevresel stres, toxicants, uyuşturucu ve chemopreventive ajanlar için özetlemek için ilk gösteri modelidir.
Renilla luciferase (rLuc) ve ateş böceği luciferase enzimatik aktivite için işleme ardından gerektirmeyen ve hemen sonra çeviri genetik bir muhabir olarak işlev görebilir 30-61 kDa monomeric proteinlerdir. Bir kez belgili tanımlık substrate luciferase enzim ile ilişkilendirir, katalize biyokimyasal reaksiyon bir ışık üretir. Böylece, luciferase yapıları bir gen ifade muhabir sistem vitro ve içinde vivoolarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Ancak, sirkadiyen ritim çalışmaları, luciferase muhabir yarar luciferase protein nispeten uzun yarı ömrü tarafından sınırlı (T1/2 = 3.68 h) (özellikle için kısa süre) dönem sirkadiyen gen değişiklikleri için göreli ifade; Ancak, yıl içinde çok sayıda çalışmalar başarıyla luciferase gen hızla parçalanabilir luciferase ritimleri ile daha uzun bir süre için özellikle sirkadiyen ritim gibi raporlama için gerekli olmayabilir gösteren pGL3 vektör kullanmışlardır 24 saat. Bu nedenle, bozulma luciferase vektör kullanarak bir muhabir plazmid pGL [Luc2P/Neo], hPEST (protein istikrarsızlık dizisi) içeren, mevcut için tüp bebek sirkadiyen muhabir vektör olarak kullanmak bize izin verdiği için geliştirilmiştir bioluminescence tahlil. Luc2P tarafından kodlanmış protein bir çok daha kısa yarı ömrü vardır (T1/2 = 0,84 h) ve bu nedenle, daha hızlı ve daha büyük bir büyüklük değişikliklere daha vahşi-türü, transkripsiyon faaliyette yanıt verdiği beno-ebilmek var olmak göstergeli doğru bir şekilde gerçek zamanlı16içinde PER2 düzenleyici tarafından düzenlenen luciferase ritmik ifade izlemek için kullanılır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Memeli hücrelerinde sirkadiyen saat periyodik olarak birbirine bağlı transkripsiyon/translasyonel geribesleme döngüsü tarafından düzenlenir. Bmal1 heterodimers ve saat veya Npas2 düzenleyen ve çekirdek CGs, Per2 ve Cryve çok sayıda CCGs4de dahil olmak üzere E-box öğelerine bağlama tarafından sirkadiyen transkripsiyon. Onlar heterodimers, hücrede biriktikçe başına: Cry post-translationally değiştirilme tarihi ve saati: Bmal1 transkripsiyon faaliyet bastırma…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu eser 2012 toplum, toksikoloji (SOT tarafından) desteklenen-Colgate Palmolive Grant değiştirici araştırma (M. Fang) ve uluslararası işbirliği araştırma fonu hayvan ve bitki karantina ajansı, Kore (M. Fang), ve NIEHS vermek P30ES005022 (H. Zarbl). Biz Dr Zheng Chen (McGovern Tıp Fakültesi Üniversitesi’nde Teksas Sağlık Bilimleri Merkezi Houston) teşekkür etmek için Bay Shao-An Juan yaptığı deneysel yardım için ve Bayan Kimi Nakata onun kanıt okumak için yararlı onun tartışma istiyorum.
Materials
| pLS[hPER2P/rLuc/Puro] vector | SwitchGear Genomics | S700000 | customized vector |
| pGL4.18[Luc2P/Neo] vector | Promega | 9PIE673 | destabilized luciferase expression vector |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224041 | For subcloning |
| TOPO TA cloning kit | Invitrogen | K4500-02 | with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli |
| Sac I | New England BioLabs | R0156S | Restriction enzyme |
| Hind III-HF | New England BioLabs | R3104S | Restriction enzyme |
| CutSmart buffer | New England BioLabs | B7204S | Restriction enzyme buffer |
| DNA gel extraction kit | Qiagen | 28704 | Purify DNA fragments from agarose gel |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | DNA clean up |
| LB Miller's modification | TEKNOVA | L8600 | For transformed E. Coli culture |
| LB Agar Plate | TEKNOVA | L1902 | For white/blue selection |
| QIAprep spin miniprep Kit | Qiagen | 27104 | For extraction of plasmide DNA |
| EndoFree plasmid maxi prep Kit | Qiagen | 12362 | For extraction of plasmide DNA |
| FuGene HD | Promega | E2311 | Transfection reagent |
| Opti-MEM reduced serum medium | Invitrogen | 31985-062 | For transfection |
| MCF10A cell line | American Type Culture Collection | CRL-10317 | Mammary Epithelial Cells |
| MEGM BulletKit | Lonza | CC-3150 | Mammary Epithelial Growth Medium |
| MEBM | Lonza | CC-3151 | Mammary Epithelial Basal Medium |
| MEGM SingleQuot Kit | Lonza | CC-4136 | Suppliments & Growth Factors |
| ReagentPack | Lonza | CC-5034 | Reagent for subculture |
| D-PBS (10X) | Sigma | D1408 | Wash cells in culture dishes |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen | 10977 | Dilute 10X D-PBS |
| Tissue culture dish (35 mm) | BD/Falcon | 353001 | cell culture dish suitable to LumiCycle |
| Silicon grease | Fisher | NC9044707 | For sealing dish with recording medium |
| Round cover glass | Harvard Bioscience | 64-1500 (CS-40R) | For sealing dish with recording medium |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Supplement for growth medium |
| G418 sulfate (Geniticin) | Invitrogen | 10131035 | Antibiotic for selection of stabliy transfected cells |
| Ampicillin | Sigma | A9393 | For colony selection |
| Forskolin | Sigma | F6886 | Synchronization agent |
| Melatonin | Sigma | M5250 | Synchronization agent |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Synchronization agent |
| Horse serum | Sigma | H1138 | Synchronization agent |
| d-Luciferin, sodium salt | Invitrogen | L2912 | Luciferase substrate |
| IC261 | Sigma | 10658 | Positive control for circadian disruptor |
| Methylnitrosourea (NMU) | Sigma | N1517 | Mammary specific carcinogen |
| Methylselenocysteine (MSC) | Sigma | M6680 | Organic selenium (chemopreventive agent) |
| EX527 | Sigma | E7034 | SIRT1 specific inhibitor |
| Cambinol | Sigma | C0494 | SIRT1 & SIRT2 inhibitor |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 8000 | Quantify nucleotide |
| GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | N805-0200 | For molecular biology experiment |
| CO2 Incubator | NAPCO | Series 8000 DH | For cell culture at 5% CO2 at 37 °C |
| Desktop centrifuge with refrezerator | Eppendorf | 5430R | For molecular biology experiment |
| Centrifuge with swing bucket | Eppendorf | 5810 R | For cell culture |
| Inverted microscope | Nikon | 80124 | Phase contrast optional |
| Tissue culture hood | Labconco | Class II A2 | BSL-2 certified |
| LumiCycle 32 | Actimetrics | Not Available | Luminoscence detector |
References
- Akerstedt, T., et al. Night work and breast cancer in women: a Swedish cohort study. BMJ Open. 5 (4), e008127 (2015).
- Parent, M. E., El-Zein, M., Rousseau, M. C., Pintos, J., Siemiatycki, J. Night work and the risk of cancer among men. Am J Epidemiol. 176 (9), 751-759 (2012).
- Knutsson, A., et al. Breast cancer among shift workers: results of the WOLF longitudinal cohort study. Scand J Work Environ Health. 39 (2), 170-177 (2013).
- Fu, L., Lee, C. C. The circadian clock: pacemaker and tumour suppressor. Nat Rev Cancer. 3 (5), 350-361 (2003).
- Fu, L., Kettner, N. M. The circadian clock in cancer development and therapy. Prog Mol Biol Transl Sci. 119, 221-282 (2013).
- IARC. Painting, Firefighting, and Shiftwork. IARC Monographs on the Evaluation of Carcinogenic Risks to Humans. 98, 563-764 (2010).
- Zhang, X., Zarbl, H. Chemopreventive doses of methylselenocysteine alter circadian rhythm in rat mammary tissue. Cancer Prev Res (Phila Pa). 1 (2), 119-127 (2008).
- Fang, M. Z., Zhang, X., Zarbl, H. Methylselenocysteine resets the rhythmic expression of circadian and growth-regulatory genes disrupted by nitrosomethylurea in vivo. Cancer Prev Res (Phila). 3 (5), 640-652 (2010).
- Burbulla, L. F., Kruger, R. Converging environmental and genetic pathways in the pathogenesis of Parkinson’s disease. J Neurol Sci. 306 (1-2), 1-8 (2011).
- Aitlhadj, L., Avila, D. S., Benedetto, A., Aschner, M., Sturzenbaum, S. R. Environmental exposure, obesity, and Parkinson’s disease: lessons from fat and old worms. Environ Health Perspect. 119 (1), 20-28 (2011).
- Nagoshi, E., Brown, S. A., Dibner, C., Kornmann, B., Schibler, U. Circadian gene expression in cultured cells. Methods Enzymol. 393, 543-557 (2005).
- Ramanathan, C., et al. Cell type-specific functions of period genes revealed by novel adipocyte and hepatocyte circadian clock models. PLoS Genet. 10 (4), e1004244 (2014).
- Sporl, F., et al. A circadian clock in HaCaT keratinocytes. J Invest Dermatol. 131 (2), 338-348 (2011).
- Zhang, E. E., et al. A genome-wide RNAi screen for modifiers of the circadian clock in human cells. Cell. 139 (1), 199-210 (2009).
- Yoo, S. H., et al. PERIOD2::LUCIFERASE real-time reporting of circadian dynamics reveals persistent circadian oscillations in mouse peripheral tissues. Proc Natl Acad Sci U S A. 101 (15), 5339-5346 (2004).
- Leclerc, G. M., Boockfor, F. R., Faught, W. J., Frawley, L. S. Development of a destabilized firefly luciferase enzyme for measurement of gene expression. Biotechniques. 29 (3), (2000).
- Genomics, S. . Technical Note: SwitchGear methods for gene model construction and transcription start site prediction. , (2009).
- Scientific, F. . Safety Data Sheet: Ethidium bromide, 1% Solution/Molecular Biology. , (2010).
- Ausubel, F. M., Brent, R., Kingston, R. E., Moore, D. D., Seidman, J. G., Smith, J. A., Struhl, K. . Current Protocols in Molecular Biology. , (1994).
- Yoo, S. H., et al. A noncanonical E-box enhancer drives mouse Period2 circadian oscillations in vivo. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (7), 2608-2613 (2005).
- Chen, Z., et al. Identification of diverse modulators of central and peripheral circadian clocks by high-throughput chemical screening. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (1), 101-106 (2012).
- Fang, M., Guo, W. R., Park, Y., Kang, H. G., Zarbl, H. Enhancement of NAD+-dependent SIRT1 deacetylase activity by methylselenocysteine resets the circadian clock in carcinogen-treated mammary epithelial cells. Oncotarget. , (2015).
- Chen-Goodspeed, M., Lee, C. C. Tumor suppression and circadian function. J Biol Rhythms. 22 (4), 291-298 (2007).
- Balsalobre, A. Clock genes in mammalian peripheral tissues. Cell Tissue Res. 309 (1), 193-199 (2002).
- Jung-Hynes, B., Huang, W., Reiter, R. J., Ahmad, N. Melatonin resynchronizes dysregulated circadian rhythm circuitry in human prostate cancer cells. J Pineal Res. 49 (1), 60-68 (2010).
- von Gall, C., et al. Melatonin plays a crucial role in the regulation of rhythmic clock gene expression in the mouse pars tuberalis. Ann N Y Acad Sci. 1040, 508-511 (2005).
- Vujovic, N., Davidson, A. J., Menaker, M. Sympathetic input modulates, but does not determine, phase of peripheral circadian oscillators. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. 295 (1), R355-R360 (2008).
- Schofl, C., Becker, C., Prank, K., von zur Muhlen, A., Brabant, G. Twenty-four-hour rhythms of plasma catecholamines and their relation to cardiovascular parameters in healthy young men. Eur J Endocrinol. 137 (6), 675-683 (1997).
- Yu, H., et al. Circadian rhythm of circulating fibroblast growth factor 21 is related to diurnal changes in fatty acids in humans. Clin Chem. 57 (5), 691-700 (2011).
- Nakagawa, H., et al. Modulation of circadian rhythm of DNA synthesis in tumor cells by inhibiting platelet-derived growth factor signaling. J Pharmacol Sci. 107 (4), 401-407 (2008).
- Yang, X., Guo, M., Wan, Y. J. Deregulation of growth factor, circadian clock, and cell cycle signaling in regenerating hepatocyte RXRalpha-deficient mouse livers. Am J Pathol. 176 (2), 733-743 (2010).
- Virag, L. Structure and function of poly(ADP-ribose) polymerase-1: role in oxidative stress-related pathologies. Curr Vasc Pharmacol. 3 (3), 209-214 (2005).
- Kon, N., Sugiyama, Y., Yoshitane, H., Kameshita, I., Fukada, Y. Cell-based inhibitor screening identifies multiple protein kinases important for circadian clock oscillations. Commun Integr Biol. 8 (4), e982405 (2015).
- Ramanathan, C., Khan, S. K., Kathale, N. D., Xu, H., Liu, A. C. Monitoring Cell-autonomous Circadian Clock Rhythms of Gene Expression Using Luciferase Bioluminescence Reporters. J Vis Exp. (67), e4234 (2012).
- Welsh, D. K., Yoo, S. H., Liu, A. C., Takahashi, J. S., Kay, S. A. Bioluminescence imaging of individual fibroblasts reveals persistent, independently phased circadian rhythms of clock gene expression. Curr Biol. 14 (24), 2289-2295 (2004).
