इन विट्रो Bioluminescence परख स्तन उपकला कोशिकाओं में Circadian ताल की विशेषता के लिए
Summary
एक इन विट्रो bioluminescence परख स्तन उपकला कोशिकाओं में सेलुलर circadian ताल का निर्धारण करने के लिए प्रस्तुत किया जाता है । इस विधि स्तनधारी सेल रिपोर्टर का उपयोग करता है के नियंत्रण के तहत अस्थिर luciferase व्यक्त plasmids अवधि 2 जीन प्रमोटर । यह circadian ताल पर अंग विशेष प्रभाव का मूल्यांकन करने के लिए अन्य कोशिका प्रकार के लिए अनुकूलित किया जा सकता है.
Abstract
circadian ताल एक मौलिक शारीरिक सभी जीवों कि जीन अभिव्यक्ति से सोने के व्यवहार को लेकर प्रक्रियाओं को नियंत्रित करता है में मौजूद प्रक्रिया है । रीढ़ में, circadian ताल दोनों suprachiasmatic नाभिक में कार्य करता है कि एक आणविक थरथरानवाला द्वारा नियंत्रित किया जाता है (SCN; सेंट्रल पेसमेकर) और व्यक्तिगत कोशिकाओं सबसे परिधीय ऊतकों को शामिल. इससे भी महत्वपूर्ण बात, प्रकाश के लिए जोखिम से circadian ताल के विघटन-रात में, पर्यावरण तनाव और/या विषालु पुराने रोगों और उंर बढ़ने का खतरा बढ़ के साथ जुड़ा हुआ है । एजेंटों है कि केंद्रीय और/या परिधीय जैविक घड़ियों को बाधित कर सकते है की पहचान करने की क्षमता है, और एजेंटों है कि रोकने या circadian व्यवधान के प्रभाव को कम कर सकते हैं, पुराने रोगों की रोकथाम के लिए महत्वपूर्ण निहितार्थ है । हालांकि कुतर मॉडलों के लिए जोखिम और एजेंटों की पहचान करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि प्रेरित या रोकने/circadian व्यवधान, इन प्रयोगों पशुओं की बड़ी संख्या की आवश्यकता है । vivo में अध्ययन भी महत्वपूर्ण संसाधनों और बुनियादी सुविधाओं की आवश्यकता है, और शोधकर्ताओं को पूरी रात काम करने की आवश्यकता है । इस प्रकार, वहां एक सेल प्रकार इन विट्रो प्रणाली के लिए उचित विभिंन अंगों और रोग राज्यों से कोशिका प्रकार में पर्यावरण circadian विघटनकारी और बढ़ाने के लिए स्क्रीन के लिए एक तत्काल जरूरत है । हम एक वेक्टर है कि मानव अवधि 2 जीन प्रमोटर के नियंत्रण में युकेरियोटिक कोशिकाओं में अस्थिर luciferase के ड्राइव प्रतिलेखन का निर्माण किया । इस circadian रिपोर्टर का निर्माण छुरा मानव स्तन उपकला कोशिकाओं में transfected था, और circadian उत्तरदायी रिपोर्टर कोशिकाओं को विकसित करने के लिए चयनित किया गया था इन विट्रो bioluminescence परख. यहां, हम स्थापित करने और परख सत्यापित करने के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं । हम आगे अवधारणा के सबूत के लिए विवरण प्रदान प्रयोगों हमारे इन विट्रो परख की क्षमता का प्रदर्शन करने के लिए सेलुलर जैविक घड़ी पर विभिंन रसायनों के vivo में प्रभाव दोहराऊंगा । परिणाम संकेत मिलता है कि परख सेल प्रकार की एक किस्म के लिए दोनों पर्यावरणीय अवरोधकों और circadian घड़ियों के chemopreventive बढ़ाने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है ।
Introduction
circadian घड़ी जीन की प्रतिदिन अभिव्यक्ति से जैविक प्रक्रियाओं की एक विस्तृत श्रृंखला को विनियमित करने के लिए लगभग 24 एच महामारी विज्ञान के अध्ययन के एक आवधिक के साथ एक उंमीद के मुताबिक लय में व्यवहार नींद दृढ़ता से सुझाव है कि circadian की पुरानी व्यवधान ताल नर्स और उड़ान कैमरों1,2,3सहित पाली श्रमिकों में स्तन और प्रोस्टेट कैंसर का खतरा बढ़ जाता है । इन निष्कर्षों को कुतर अध्ययनों से पुष्टि कर रहे हैं, लगातार प्रकाश, प्रकाश में है कि जोखिम का प्रदर्शन-रात, या प्रकाश चक्र कि जेट अंतराल वृद्धि ट्यूमर घटना की नकल और ट्यूमर विकास में तेजी4,5। दोनों मानव और कुतर अध्ययन के आंकड़ों के आधार पर, कैंसर वर्गीकृत शिफ्ट पर अनुसंधान के लिए अंतरराष्ट्रीय एजेंसी-२०१०6में एक संभावित मानव यलो (प्रकार 2a) के रूप में काम करते हैं ।
इससे पहले, हमने दिखाया है कि स्तन ट्यूमर विशिष्ट यलो, एन-nitroso-एन-methylurea (NMU) की एक एकल यलो खुराक, प्रमुख circadian जीन (सीजीएस) की circadian अभिव्यक्ति बाधित (जैसे, अवधि 2 , Per2) और कई circadian नियंत्रित जीन (CCGs), प्रमुख डीएनए नुकसान उत्तरदायी और (DDRR) लक्ष्य स्तन ग्रंथि में जीन (लेकिन जिगर में नहीं) की मरंमत सहित । इसके अलावा, आहार एल-मिथाइल-selenocysteine (MSC) के एक chemopreventive आहार द्वारा सामांय के प्रति दोनों Per2 और DDRR जीन की circadian अभिव्यक्ति को रीसेट ६३% द्वारा ट्यूमर की घटनाओं में कमी । ये निष्कर्ष सबसे पहले circadian ताल, केमिकल कैंसरजनन और chemoprevention7,8के बीच एक यंत्रवत लिंक दिखा रहे थे । vivo में circadian जीन अभिव्यक्ति को बाधित करने के लिए दिखाया गया अन्य पर्यावरणीय विषालु के लिए एक्सपोजर भी पर्यावरण रोगों के बढ़ा जोखिम के साथ9,10जुड़े हैं. तंत्र है कि पर्यावरण विषालु और रोगजनन द्वारा circadian व्यवधान लिंक को समझना mechanistically के लिए नेतृत्व कर सकते है रोग की रोकथाम के लिए दृष्टिकोण पर आधारित है । हालांकि, जोखिम और circadian लय के बीच बातचीत को परिभाषित करने के उद्देश्य से अध्ययन आमतौर पर vivo में प्रदर्शन कर रहे हैं । vivo में एक ठेठ circadian ताल पर प्रभाव की जांच प्रयोग में पशुओं की बड़ी संख्या की आवश्यकता है, के रूप में कम से तीन नियंत्रण और तीन उजागर पशुओं से ऊतकों को एकत्र किया जाना चाहिए हर 3-4 एच पर एक 24 या ४८ ज अवधि । इन विट्रो प्रणाली में एक मांय का विकास है कि vivo टिप्पणियों और तंत्र में recapitulates इसलिए न केवल आवश्यक पशुओं की संख्या में कमी होगी, लेकिन यह भी नाटकीय रूप से प्रयोगात्मक लागत को कम करने और आवश्यकता है कि शोधकर्ताओं ने एक 24-48 ज अवधि में लगातार काम करते हैं । इसके अलावा, एक मांय इन विट्रो प्रणाली यौगिकों और/या आनुवंशिक परिवर्तन के उच्च प्रवाह स्क्रीनिंग के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है कि circadian ताल, या पर्यावरणीय तनाव या विषालु के लिए अपनी प्रतिक्रिया को प्रभावित । इसलिए, रणनीतिक संयोजन में इन विट्रो और vivo में मॉडल और प्रयोगों अलग ध्यान केंद्रित करने के साथ विभिन्न अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए आवश्यक हैं ।
स्तनधारियों में, circadian थरथरानवाला न केवल SCN के विशेष ंयूरॉंस में मौजूद है, लेकिन यह भी सबसे परिधीय कोशिका प्रकार में । इन आणविक घड़ियों स्थापित fibroblast सेल लाइनों में उन लोगों के लिए और भ्रूण या वयस्क पशुओं से प्राथमिक fibroblasts में समान हैं; हालांकि, वहां ऊतक प्रकार विशिष्ट सेलुलर मॉडल11के लिए एक की जरूरत है । नतीजतन, vivo मेंहरकत गतिविधि के पारंपरिक अध्ययन, SCN explants पूर्व vivo, और सेल आधारित इन विट्रो परख में अमर fibroblast कोशिकाओं में व्यापक रूप से सेल-स्वायत्त circadian दोषों का अध्ययन करने के लिए उपयोग किया जाता है. हालांकि, वहां कोई संकेत है कि एक इन विट्रो fibroblast सेल आधारित परख दोहराऊंगा कर सकते है circadian तंत्र और प्रतिक्रियाओं vivo मेंअंय परिधीय अंगों की कोशिकाओं में मौजूद सबूत है । विभिन्न प्रकार के सेल जीन अभिव्यक्ति, xenobiotic चयापचय, और DDRR के विशिष्ट पैटर्न हो सकता है, और विषाक्तता और circadian जीन अभिव्यक्ति के बीच संबंध सेल प्रकार विशिष्ट और/या अलग शारीरिक मापदंडों द्वारा संग्राहक हो सकता है । इसके अलावा, fibroblast-आधारित प्रणालियों में circadian oscillators पर्यावरणीय विषालु, तनाव और निवारक एजेंटों के लिए प्रतिक्रियाओं के लिए पूरी तरह से मूल्यांकन नहीं किया गया है कि रोग के विकास और रोकथाम के तंत्र के लिए जोखिम लिंक । इस प्रकार, वहाँ सतही के लिए एक की जरूरत है, मान्य सेल प्रकार विशिष्ट, इन विट्रो bioluminescence परख अंग विशिष्ट पर्यावरणीय circadian व्यवधानों का अध्ययन करने के लिए. हालांकि सेलुलर घड़ी मॉडल की एक किस्म (जैसे, जिगर, keratinocytes, और वसा कोशिकाओं में, साथ ही एक ऑस्टियो सेल लाइन) हाल के वर्षों में विकसित किया गया है12,13,14, 15, परख यहां वर्णित स्तन उपकला कोशिकाओं में पहली सेलुलर घड़ी मॉडल है, और पहली प्रदर्शन दोहराऊंगा करने के लिए vivo में पर्यावरण तनाव, विषालु, ड्रग्स, और chemopreventive एजेंटों के लिए प्रतिक्रियाओं ।
Renilla luciferase (rLuc) और जुगनू luciferase हैं 30-61 केडीए monomeric प्रोटीन कि posttranslational गतिविधि के लिए एंजाइमी प्रोसेसिंग की आवश्यकता नहीं है और एक आनुवंशिक रिपोर्टर के रूप में तुरंत अनुवाद पर कार्य कर सकते हैं । एक बार luciferase एंजाइम के साथ सब्सट्रेट एसोसिएट्स, जैव रासायनिक प्रतिक्रिया catalyzed प्रकाश की एक फ्लैश उत्पन्न करता है. इस प्रकार, luciferase constructs व्यापक रूप से इन विट्रो में एक जीन अभिव्यक्ति रिपोर्टर प्रणाली और vivo मेंके रूप में प्रयोग किया जाता है । हालांकि, circadian ताल अध्ययन में, luciferase रिपोर्टर की उपयोगिता अपेक्षाकृत लंबे luciferase प्रोटीन (टी1/2 = ३.६८ एच) की अवधि (विशेष रूप से छोटी अवधि के लिए) सापेक्ष circadian जीन में परिवर्तन के लिए जीवन द्वारा सीमित है अभिव्यक्ति; हालांकि, वर्षों में कई अध्ययनों को सफलतापूर्वक pGL3 वेक्टर में luciferase जीन का इस्तेमाल किया है, यह दर्शाता है कि तेजी से क्षरण luciferase circadian लय रिपोर्टिंग के लिए आवश्यक नहीं हो सकता है, विशेष रूप से एक लंबी अवधि के साथ लय के लिए, जैसे 24 एच. इसलिए, एक रिपोर्टर प्लाज्मिड अस्थिर luciferase वेक्टर का उपयोग कर, pGL [Luc2P/Neo], कि hPEST शामिल है (एक प्रोटीन स्थिरीकरण अनुक्रम) विकसित किया गया है, हम इसे एक circadian रिपोर्टर के रूप में उपयोग करने के लिए हमारे वर्तमान के लिए वेक्टर की अनुमति इन विट्रो bioluminescence परख । Luc2P द्वारा इनकोडिंग प्रोटीन एक बहुत कम आधा जीवन (T1/2 = ०.८४ ज) है और इसलिए, और अधिक जल्दी से और अधिक से अधिक भयावहता के साथ जवाब transcriptional गतिविधि में जंगली प्रकार से परिवर्तन, मैंndicating है कि यह सही वास्तविक समय16में PER2 प्रमोटर द्वारा विनियमित luciferase की लयबद्ध अभिव्यक्ति की निगरानी के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है ।
Protocol
1. PER2 प्रवर्तक संचालित अस्थिर Luciferase रिपोर्टर वेक्टर एक स्वनिर्धारित pLS खरीद [ hPER2P / rLuc /Puro] वेक्टर जिसमें सीडीएनए एंकोडिंग rLuc और मानव PER2 प्रवर्तक अंश (hPER2P, ९४१ bp) के बीच स्थल पर सैक I और …
Representative Results
Discussion
स्तनधारी कोशिकाओं में, circadian घड़ी की आवधिक परस्पर transcriptional/शोधों प्रतिक्रिया छोरों द्वारा विनियमित है । । Bmal1 और या तो घड़ी या Npas2 के Heterodimers कोर सीजीएस के प्रवर्तकों में ई-बॉक्स तत्वों को बाध्यकारी द्वारा circadian प्…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम २०१२ सोसायटी ऑफ विषविज्ञान (मदोन्मत्त) द्वारा समर्थित किया गया था-Alterative अनुसंधान के लिए कोलगेट पामोलिव ग्रांट (एम. फेंग) और पशु और संयंत्र संगरोध एजेंसी, कोरिया गणराज्य (एम. फेंग) से अंतरराष्ट्रीय सहयोग अनुसंधान निधि, और NIEHS अनुदान P30ES005022 (H. Zarbl) । हम Dr. झेंग चेन (ह्यूस्टन में टेक्सास स्वास्थ्य विज्ञान केंद्र के विश्वविद्यालय में McGovern मेडिकल स्कूल) अपने उपयोगी चर्चा के लिए शुक्रिया अदा करना चाहूंगा, श्री शाओ-अपने प्रयोगात्मक सहायता के लिए एक जुआन, और सुश्री किमी नकटा उसे सबूत पढ़ने के लिए ।
Materials
| pLS[hPER2P/rLuc/Puro] vector | SwitchGear Genomics | S700000 | customized vector |
| pGL4.18[Luc2P/Neo] vector | Promega | 9PIE673 | destabilized luciferase expression vector |
| T4 DNA ligase | Invitrogen | 15224041 | For subcloning |
| TOPO TA cloning kit | Invitrogen | K4500-02 | with One Shot TOP10 Chemically Competent E. coli |
| Sac I | New England BioLabs | R0156S | Restriction enzyme |
| Hind III-HF | New England BioLabs | R3104S | Restriction enzyme |
| CutSmart buffer | New England BioLabs | B7204S | Restriction enzyme buffer |
| DNA gel extraction kit | Qiagen | 28704 | Purify DNA fragments from agarose gel |
| PCR Purification Kit | Qiagen | 28104 | DNA clean up |
| LB Miller's modification | TEKNOVA | L8600 | For transformed E. Coli culture |
| LB Agar Plate | TEKNOVA | L1902 | For white/blue selection |
| QIAprep spin miniprep Kit | Qiagen | 27104 | For extraction of plasmide DNA |
| EndoFree plasmid maxi prep Kit | Qiagen | 12362 | For extraction of plasmide DNA |
| FuGene HD | Promega | E2311 | Transfection reagent |
| Opti-MEM reduced serum medium | Invitrogen | 31985-062 | For transfection |
| MCF10A cell line | American Type Culture Collection | CRL-10317 | Mammary Epithelial Cells |
| MEGM BulletKit | Lonza | CC-3150 | Mammary Epithelial Growth Medium |
| MEBM | Lonza | CC-3151 | Mammary Epithelial Basal Medium |
| MEGM SingleQuot Kit | Lonza | CC-4136 | Suppliments & Growth Factors |
| ReagentPack | Lonza | CC-5034 | Reagent for subculture |
| D-PBS (10X) | Sigma | D1408 | Wash cells in culture dishes |
| UltraPure Distilled Water | Invitrogen | 10977 | Dilute 10X D-PBS |
| Tissue culture dish (35 mm) | BD/Falcon | 353001 | cell culture dish suitable to LumiCycle |
| Silicon grease | Fisher | NC9044707 | For sealing dish with recording medium |
| Round cover glass | Harvard Bioscience | 64-1500 (CS-40R) | For sealing dish with recording medium |
| Cholera toxin | Sigma | C8052 | Supplement for growth medium |
| G418 sulfate (Geniticin) | Invitrogen | 10131035 | Antibiotic for selection of stabliy transfected cells |
| Ampicillin | Sigma | A9393 | For colony selection |
| Forskolin | Sigma | F6886 | Synchronization agent |
| Melatonin | Sigma | M5250 | Synchronization agent |
| Dexamethasone | Sigma | D4902 | Synchronization agent |
| Horse serum | Sigma | H1138 | Synchronization agent |
| d-Luciferin, sodium salt | Invitrogen | L2912 | Luciferase substrate |
| IC261 | Sigma | 10658 | Positive control for circadian disruptor |
| Methylnitrosourea (NMU) | Sigma | N1517 | Mammary specific carcinogen |
| Methylselenocysteine (MSC) | Sigma | M6680 | Organic selenium (chemopreventive agent) |
| EX527 | Sigma | E7034 | SIRT1 specific inhibitor |
| Cambinol | Sigma | C0494 | SIRT1 & SIRT2 inhibitor |
| NanoDrop Spectrophotometer | Thermo Scientific | NanoDrop 8000 | Quantify nucleotide |
| GeneAmp PCR System 9700 | Applied Biosystems | N805-0200 | For molecular biology experiment |
| CO2 Incubator | NAPCO | Series 8000 DH | For cell culture at 5% CO2 at 37 °C |
| Desktop centrifuge with refrezerator | Eppendorf | 5430R | For molecular biology experiment |
| Centrifuge with swing bucket | Eppendorf | 5810 R | For cell culture |
| Inverted microscope | Nikon | 80124 | Phase contrast optional |
| Tissue culture hood | Labconco | Class II A2 | BSL-2 certified |
| LumiCycle 32 | Actimetrics | Not Available | Luminoscence detector |
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