Anrikning av tvättmedel-olösligt Protein aggregat från människahjärnan efter döden
Summary
Ett förkortat fraktionering protokoll för anrikningen av tvättmedel-olösligt protein aggregat från människahjärnan efter döden beskrivs.
Abstract
I denna studie beskriver vi ett förkortat steg fraktionering protokoll för anrikningen av tvättmedel-olösligt protein aggregat från efter döden människohjärnan. Det Joniska tvättmedlet N-lauryl-Sarkosin (sarkosyl) solubilizes effektivt inföding vikta proteiner i hjärnvävnad tillåta berikning av tvättmedel-olösligt protein aggregat från en rad olika neurodegenerativa proteinopathies, såsom Alzheimers sjukdom (AD), Parkinsons sjukdom och ALS och prionsjukdomar. Mänsklig kontroll och AD efter döden hjärnans vävnader var homogeniserad och sedimenterade vid ultracentrifugering i närvaro av sarkosyl att berika tvättmedel-olösligt protein aggregat inklusive patologisk fosforyleras tau, kärnan i neurofibrillära tovor i AD. Western blotting visat differentiell lösligheten av aggregerade fosforyleras-tau och rengöringsmedel-lösliga proteinet, tidig Endosome Antigen 1 (EEA1) i kontroll och AD hjärna. Proteomiska analys visade också anrikning av β-amyloid (Aβ), tau, snRNP70 (U1 – 70 K), och apolipoprotein E (APOE) i sarkosyl olösliga fraktioner av AD hjärnan jämfört med de av kontroll, överensstämmer med tidigare vävnad fraktionering strategier . Sålunda, detta enkla anrikning protokoll är idealisk för ett brett spektrum av experimentella applikationer alltifrån Western blotting och funktionellt protein samtidig aggregering analyser till mass spectrometry-baserad proteomik.
Introduction
Neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers sjukdom (AD), Parkinsons sjukdom (PD), Huntingtons sjukdom (HD), amyotrofisk lateralskleros (ALS) och de närbesläktade prionsjukdomar är proteinopathies kännetecknas av gradvis ackumulering av tvättmedel-olösligt protein aggregat i hjärnan med tillhörande kognitiv nedgång. 1 , 2 delad patologiska funktionen tros spela en central roll i etiologi och patofysiologi av dessa neurodegenerativa sjukdomar. 2 dessa aggregat består typiskt av Polymera amyloid fibrer, vilka består av upprepade enheter av felveckning protein uppvisar kors β-struktur. 1 , 2 , 3 , 4 biokemiskt, amyloid aggregat är mycket motståndskraftiga mot kemisk eller termisk denaturering och lösbarhet,3 som presenterar unika utmaningar att deras rening, analys och studera via traditionella biokemiska tekniker. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 föga förvånande den tvättmedel-olöslig protein fraktionen har varit i fokus för mycket forskning patofysiologin bakom neurodegenerativa sjukdomar som inbegriper ackumulering av felveckning proteiner. 6 , 12 , 13 , 14
Biokemiska fraktionering tekniker har ofta använts för att berika den olösliga i tvättmedel fraktionen från efter döden hjärnan homogenates. 6 , 12 , 13 , 14 en av de vanligaste metoderna innebär sekventiella extraktionen av vävnad homogenates med buffertar och rengöringsmedel öka stringens, följt av ultracentrifugering att partitionera de lösliga och olösliga fraktionerna. En vanligt förekommande sekventiell fraktionering protokoll6,14 innebär homogenisering av djupfrysta vävnadsprover i en buffert för tvättmedel-fri låg salthalt (LS) och de resulterande olösliga pelletarna extraheras sedan sekventiellt med buffertar som innehåller hög salthalt, icke-joniskt rengöringsmedel, hög sackaros, som joniskt rengöringsmedel och slutligen chaotropes urea. 6 , 14 en uppenbar nackdel med sådana en sekventiell fraktionering protokoll är avsevärd tid och arbetskraft engagemang krävs för att slutföra dem. Inklusive homogenisering och ultracentrifugering, ett typiskt fem steg fraktionering protokoll kan ta flera timmar eller dagar att slutföra. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 dessutom så många patologiska protein aggregat förblir olösliga i alla utom de mest krävande förhållande19,20 de flesta av de genererade fraktionerna är av begränsat värde. Således är mindre-stränga fraktionering stegen använder salt kickkoncentrationer och icke-joniskt rengöringsmedel i stort sett överflödig.
Tidigare studier har visat att det Joniska tvättmedlet N-lauryl-Sarkosin (sarkosyl) är en utmärkt kandidat för ett förenklat steg tvättmedel fraktionering protokoll. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 som ett denatureringen rengöringsmedel, sarkosyl är tillräckligt stränga för att solubilize den stora majoriteten av inföding vikta proteiner i hjärnan utan solubilizing felveckning protein aggregat består av beta-amyloid (Aβ),6,11 fosforyleras tau (pTau),6 tjära DNA-bindande protein 43 (TDP-43),14 alfa-synuklein,12,13 skrapie,23 eller U1 små nukleära ribonucleoproteins (U1 snRNP) såsom U1 – 70 K. 5 , 21 , 22 Sarkosyl är mindre stränga än allestädes närvarande anjoniska tvättmedel dodecyl natriumsulfat (SDS), bevarar det mindre robust Oligomera former av felveckning protein aggregat som inte tål SDS behandling. 9
Tidigare har beskrivit vi ett förkortat tvättmedel-fraktionering protokoll som uppnått resultat jämförbara med de mer arbetskrävande metoderna som sekventiella fraktionering. 5 genom att utelämna de mindre stränga fraktionering steg, vi kunde utveckla ett lättköpt steg fraktionering protokoll för anrikningen av tvättmedel-olösligt protein aggregat från efter döden mänskliga hjärnan. 5 detta detaljerade protokoll som beskrivs häri är väl lämpad för en rad olika experimentella tillämpningar som sträcker sig från Western blotting och mass spectrometry-baserad proteomik för att funktionellt protein Skellefteåsjukan och aggregering seedning analyser. 5 , 6 , 21
Protocol
Representative Results
Discussion
Häri vi introducera och diskutera ett förkortat steg tvättmedel-fraktionering protokoll som gäller för en mängd olika experimentella tillämpningar som sträcker sig från mass spectrometry-baserad proteomik analys till funktionella protein Skellefteåsjukan analyser och western blotting. 5 , 6 , 7 , 10 denna metod är kanske mest effektiv när den används att studera neurodegenerativa p…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Författarna tackar Drs. Jim Lah och Allan Levey, Emory Institutionen för neurologi, för hjälpsamma kommentarer och förslag. Detta arbete finansierades delvis av den accelererande medicin partnerskap grant (U01AG046161-02), Emory Alzheimer’s Disease Research Center (P50AG025688) och en National Institute on Aging bevilja (R01AG053960-01) N.T.S. Denna forskning var också stöds delvis av neuropatologi kärnan av Emory neurovetenskap NINDS corefaciliteter bidraget, P30NS055077.
Materials
| Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X) | Thermo Fisher | 78441 | protease & phosphatase inhibitor cocktail |
| Sonic Dismembrator System (ultrasonicator) | Fisher Scientific | FB505110 | microtip ultrasonicator |
| Optimax TLX Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 361545 | refrigerated ultracentrifuge |
| TLA120.1 rotor | Beckman Coulter | 362224 | ultracentrifuge rotor |
| 500 ul (8x34mm) polycarbonate tubes, thickwall | Beckman Coulter | 343776 | ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor |
| 4X SDS sample buffer | Home-made | N/A | SDS-PAGE |
| TCEP solution, neutral pH | Thermo Fisher | 77720 | reducing agent |
| (TBS) blocking buffer | Thermo Fisher | 37542 | blocking buffer |
| (TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20 | Thermo Fisher | 37543 | blocking buffer and antibody diluent |
| 4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-well | Thermo Fisher | NW04120BOX | precast SDS-PAGE gels |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher | B0002 | SDS-PAGE running buffer |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) | Sigma Aldrich | L5777-50G | detergent |
| 1.5 ml polypropylene Pellet Pestle | Kimble Chase | 749521-1500 | homogenization tool |
| cordless motor for Pellet Pestle | Kimble Chase | 749540-0000 | homogenization tool |
| Anti-Tau-2 (pan tau) antibody | Chemicon | MAB375 | antibodies |
| Anti-phospho-threonine 231 Tau antibody | Millipore | MAB5450 | antibodies |
| Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8) | Thermo Fisher | MN1020 | antibodies |
| Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibody | abcam | ab2900 | antibodies |
| Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher | A21058 | antibodies |
| Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher | A11374 | antibodies |
| iBlot2 Dry Blotting System | Thermo Fisher | IB21001 | Gel transfer |
| iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, mini | Thermo Fisher | IB23002 | Gel transfer |
References
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H. Toxic Proteins in Neurodegenerative Disease. Science. 296 (5575), 1991 (1991).
- Ross, C. A., Poirier, M. A. Protein aggregation and neurodegenerative disease. Nature Medicine. 10, S10-S17 (2004).
- Ramírez-Alvarado, M., Merkel, J. S., Regan, L. A systematic exploration of the influence of the protein stability on amyloid fibril formation in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (16), 8979-8984 (2000).
- Hamley, I. W. The Amyloid Beta Peptide: A Chemist’s Perspective. Role in Alzheimer’s and Fibrillization. Chem Rev. 112 (10), 5147-5192 (2012).
- Diner, I., et al. Aggregation Properties of the Small Nuclear Ribonucleoprotein U1-70K in Alzheimer Disease. J. Biol. Chem. 289 (51), 35296-35313 (2014).
- Gozal, Y. M., et al. Proteomics Analysis Reveals Novel Components in the Detergent-Insoluble Subproteome in Alzheimer’s Disease. J. Proteome Res. 8 (11), 5069-5079 (2009).
- Hales, C. M., et al. Changes in the detergent-insoluble brain proteome linked to amyloid and tau in Alzheimer’s Disease progression. PROTEOMICS. , (2016).
- Julien, C., Bretteville, A., Planel, E., Sigurdsson, E. M., Calero, M., Gasset, M. . Amyloid Proteins: Methods and Protocols. , 473-491 (2012).
- Nizhnikov, A. A., et al. Proteomic Screening for Amyloid Proteins. PLoS ONE. 9 (12), e116003 (2014).
- Seyfried, N. T., et al. Quantitative analysis of the detergent-insoluble brain proteome in frontotemporal lobar degeneration using SILAC internal standards. J. Proteome Res. 11 (5), 2721-2738 (2012).
- Woltjer, R. L., et al. Proteomic determination of widespread detergent insolubility, including Aβ but not tau, early in the pathogenesis of Alzheimer’s disease. FASEB J. , (2005).
- Miake, H., Mizusawa, H., Iwatsubo, T., Hasegawa, M. Biochemical Characterization of the Core Structure of α-Synuclein Filaments. J. Biol. Chem. 277 (21), 19213-19219 (2002).
- Hasegawa, M., et al. Phosphorylated α-Synuclein Is Ubiquitinated in α-Synucleinopathy Lesions. J. Biol. Chem. 277 (50), 49071-49076 (2002).
- Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science. 314 (5796), 130 (2006).
- Bishof, I., Diner, I., Seyfried, N. An Intrinsically Disordered Low Complexity Domain is Required for U1-70K Self-association. FASEB J. 29 (Suppl 1), (2015).
- Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).
- Noguchi, A., et al. Isolation and Characterization of Patient-derived, Toxic, High Mass Amyloid β-Protein (Aβ) Assembly from Alzheimer Disease Brains. J. Biol. Chem. 284 (47), 32895-32905 (2009).
- Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer’s disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (41), 16562-16567 (2013).
- Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer’s β-Amyloid Protein Is Covalently Modified when Dissolved in Formic Acid. J Neurochem. 54 (6), 2050-2056 (1990).
- Yang, L. -. S., Gordon-Krajcer, W., Ksiezak-Reding, H. Tau Released from Paired Helical Filaments with Formic Acid or Guanidine Is Susceptible to Calpain-Mediated Proteolysis. J Neurochem. 69 (4), 1548-1558 (1997).
- Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer’s disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).
- Hales, C. M., et al. U1 small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) aggregate in Alzheimer’s disease due to autosomal dominant genetic mutations and trisomy 21. Mol Neurodegener. 9 (1), 15 (2014).
- Xiong, L. -. W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein. J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).
- Mirra, S. S., et al. The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer’s Disease (CERAD). Part II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer’s disease. Neurology. 41 (4), 479-486 (1991).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
- Guo, J. L., et al. Unique pathological tau conformers from Alzheimer’s brains transmit tau pathology in nontransgenic mice. J. Exp. Med. 213 (12), 2635-2654 (2016).
- Matveev, S. V., et al. A distinct subfraction of Aβ is responsible for the high-affinity Pittsburgh compound B-binding site in Alzheimer’s disease brain. J Neurochem. 131 (3), 356-368 (2014).
