Summary
ويرد وصف بروتوكولا تجزئة مختصر لإثراء المجاميع البروتين تستعصي على الحل المنظفات من الدماغ البشري تشريح الجثة.
Abstract
في هذه الدراسة، ونحن تصف بروتوكولا يختصر خطوة واحدة تجزئة لإثراء المجاميع البروتين تستعصي على الحل المنظفات من الدماغ البشري تشريح الجثة. المنظفات الأيونية ن-سولفات-ساركوسيني (ساركوسيل) سولوبيليزيس فعالية البروتينات مطوية أصلاً في أنسجة المخ مما يسمح في إثراء المجاميع البروتين تستعصي على الحل المنظفات من طائفة واسعة من بروتينوباثيس الأعصاب، مثل مرض الزهايمر (AD) ومرض باركنسون والتصلب العضلي الجانبي وأمراض بريون. كانت سيطرة الإنسان وأنسجة المخ تشريح الجثة الإعلانية المتجانس ورسابه تنبيذ فائق حضور ساركوسيل لإثراء المجاميع البروتين تستعصي على الحل المنظفات الصناعية بما في ذلك تاو فوسفوريلاتيد باثولوجي، العنصر الأساسي من نيوروفيبريلاري التشابك في الإعلان. النشاف الغربية أظهرت أن القابلية للذوبان التفاضلية تاو فوسفوريلاتيد مجمعة والبروتين للذوبان المنظفات، 1 مستضد دخلول المبكر (EEA1) في السيطرة والدماغ الإعلانية. كما كشف تحليل البروتين إثراء بيتا-اميلويد (Aβ)، تاو، snRNP70 (U1-70 ك)، والابوليبوبروتين ه (الذين) في كسور الدماغ الإعلانية مقارنة بتلك التي تحكم، تمشيا مع الاستراتيجيات السابقة في وجود أنسجة تستعصي على الحل ساركوسيل . وهكذا، هذا البروتوكول تخصيب بسيطة مثالية لمجموعة واسعة من تطبيقات تجريبية بدءاً من النشاف الغربية والبروتين وظيفية فحوصات التجميع المشارك البروتيوميات الجماعي القائم على قياس الطيف الكتلي.
Introduction
أمراض الأعصاب مثل مرض الزهايمر (AD) ومرض باركنسون (PD) ومرض هنتنغتون (HD)، والتصلب العضلي الجانبي (المرض) وأمراض بريون وثيق الصلة بروتينوباثيس تتميز بتراكم تدريجي انخفاض المجاميع البروتين المنظفات الذوبان في الدماغ مع مرافقة المعرفية. 1 , ويعتقد أن تلعب دوراً مركزياً في المسببات والفيزيولوجيا المرضية لهذه الأمراض الأعصاب 2 هذه الميزة المرضية المشتركة. 2 هذه المجاميع وعادة ما تتألف من ألياف اميلويد البوليمرية، التي تتكون من تكرار وحدات من البروتين تجمعات العارضة عبر β-الهيكل. 1 , 2 , 3 , 4 المتحلل، المجاميع اميلويد هي شديدة المقاومة تمسخ الكيميائية أو الحرارية وسولوبيليزيشن،3 التي تشكل تحديات فريدة من نوعها لتنقية بهم، تحليل ودراسة عن طريق التقنيات الحيوية التقليدية. 2 , 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 لا غرابة، الكسر البروتين تستعصي على الحل المنظفات قد تم تركيز الكثير من البحوث في الفسيولوجيا المرضية لأمراض الأعصاب التي تشمل تراكم البروتينات تجمعات. 6 , 12 , 13 , 14
كثيرا ما استخدمت تقنيات تجزئة البيوكيميائية لإثراء الكسر تستعصي على الحل المنظفات من homogenates الدماغ تشريح الجثة. 6 , 12 , 13 , 14 واحد من الأساليب الأكثر شيوعاً يشمل استخراج متسلسلة من الأنسجة هوموجيناتيس مع المخازن المؤقتة والمنظفات الصناعية المتزايدة الصرامة، تليها تنبيذ فائق لتقسيم الكسور القابلة للذوبان وغير قابلة للذوبان. 6،بروتوكول14 تجزئة متسلسلة استخداماً ينطوي على تجانس عينات الأنسجة المجمدة في منطقة عازلة خالية من المنظفات منخفضة ملح (LS) والكريات الناتجة غير قابلة للذوبان ثم تستخرج تسلسلياً مع المخازن المؤقتة التي تحتوي على الملح عالية، والمنظفات غير الأيونية، السكروز عالية، المنظفات الأيونية، وأخيراً تشاوتروبيس مثل اليوريا. 6 , 14 هو عيب واضح من هذه البروتوكولات تجزئة متسلسلة وقت كبير والتزام العمل المطلوب لإكمال لهم. بما في ذلك التجانس وتنبيذ فائق، يمكن اتخاذ بروتوكول نموذجي خمس خطوات تجزئة عدة ساعات أو حتى أيام لاستكمال. 4 , 6 , 7 , 10 , 15 , 16 , 17 , 18 بالإضافة إلى ذلك، يظل العديد من البروتين باثولوجي المجاميع غير قابلة للذوبان في جميع ولكن ظروف أقسى19،20 معظم الكسور التي تم إنشاؤها ذات قيمة محدودة. وهكذا، خطوات تجزئة أقل صرامة استخدام تركيزات عالية من الملح والمنظفات غير الأيونية زائدة عن الحاجة إلى حد كبير.
وقد أظهرت الدراسات السابقة أن المنظفات الأيونية ن-سولفات-ساركوسيني (ساركوسيل) مرشح ممتاز لبروتوكول مبسط تجزئة منظفات في خطوة واحدة. 5 , 6 , 12 , 13 , 14 , 21 , 22 , 23 كمطهر يشوه، ساركوسيل صرامة ما يكفي جعل الغالبية العظمى من البروتينات مطوية أصلاً في الدماغ دون سولوبيليزينج المجاميع البروتين تجمعات تتألف من اميلويد بيتا (Aβ)،6،11 تاو فوسفوريلاتيد (بتاو)،6 "القطران الحمض النووي" ملزم بروتين 43 (ماساتشوستس-43)،14 ألفا-سينوكلين أو الرعاش13 12،،23 أو U1 الصغيرة النووية ريبونوكليوبروتينس (U1 سنرنبس) مثل U1-70 ك. 5 , 21 , 22 كما ساركوسيل أقل صرامة من كبريتات دوديسيل الصوديوم المنظفات أنيونى في كل مكان (SDS)، فإنه يحافظ على أشكال oligomeric أقل متانة من المجاميع تجمعات البروتين التي لا يمكن أن تصمد أمام معاملة الحزب الديمقراطي الصربي. 9
سابقا، يمكننا وصف بروتوكولا المنظفات-تجزئة مختصر الذي حقق نتائج قابلة للمقارنة للمنهجيات تجزئة متسلسلة أكثر شاقة. 5 بحذف الخطوات تجزئة أقل صرامة، استطعنا أن وضع بروتوكول تجزئة خطوة واحدة سهلة لإثراء المجاميع البروتين تستعصي على الحل المنظفات من الدماغ البشري تشريح الجثة. 5 هذا البروتوكول التفصيلية الموضحة هنا مناسبة تماما لمجموعة واسعة من التطبيقات التجريبية تتراوح من النشاف الغربية وفحوصات البروتيوميات الجماعي القائم على قياس الطيف الكتلي misfolding البروتين وظيفية والبذر التجميع. 5 , 6 , 21
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
"بيان الأخلاق": تم الحصول على جميع أنسجة الدماغ من مرض الزهايمر أموري ' s المرض مركز البحوث (أدرك) المخ البنك. الأنسجة البشرية تشريح الجثة تم الحصول عليها تحت السليم المؤسسية استعراض المجلس (مجلس الهجرة واللاجئين) البروتوكولات.
1. التجانس ووجود
- اختيار الأنسجة
ملاحظة: تجميد أنسجة اللحاء أمامي تشريح الجثة من مراقبة صحية (Ctl) ومرضية اختيرت الإعلانية الحالات المؤكدة أموري بنك أدرك الدماغ (n = 2). أجرى تقييم توزيع البلاك اميلويد لاثيل الجثة وفقا للاتحاد إنشاء سجل لمرض الزهايمر ' s المرض شبه كمي سجل 24 من المعايير، على الرغم من أن وقيمت متشابكة نيوروفيبريلاري علم الأمراض وفقا لنظام التدريج براك. وأكد 16- الحصول على تجميد أنسجة المخ تشريح الجثة من مراقبة صحية (Ctl) ومرضية الحالات الإعلانية. استخدام حاويات الثلج الجاف وملقط وشفرة حلاقة، المكوس ~ تزن 250 ملغ أجزاء من المادة الرمادية من كل عينة الأنسجة على المتاح تريد القوارب، مع الحرص على منع الأنسجة من ذوبان الجليد. تسجيل وزن كل قطعة أن تجانس.
- المكوس ~ 250 ملغ المادة الرمادية باستخدام الملقط وأسلاك شائكة بتفتيش بصريا لتحديد العلاقة بين المادة الرمادية الخارجي والداخلي الأبيض المسألة. تجنب هذه المسألة الأبيض، والأهم من ذلك، أي الأوعية الدموية الكبيرة أو في مناطق الدموي أو السحايا ماطر العنكبوتي. الحفاظ على الأنسجة المجمدة أثناء عملية القطع بالعمل بسرعة، وكثيراً ما وضع قارب وزنها مع أنسجة المخ في حاويات البوليستيرين مع مدت الجافة
- سجل الوزن الدقيق للمادة الرمادية التي اقتطعت من كل قطعة مجمدة باستخدام رصيد التحليلي. حساب حجم المخزن المؤقت منخفضة الملح (LS) (انظر الجدول 1) اللازمة لتجانس دونس (5 مل/g أو 20% w/v)-
- إعداد 10 مل LS المخزن المؤقت مع 1 × مثبطات البروتياز والفوسفاتيز كوكتيل والبرد على مدت
- إزالة الأنسجة وزنه وقارب وزنها من الثلج الجاف والزهر أربا 2 × 2 مم تقريبا كما أنه يذوب. نقل إلى أنبوب الخالطون دونس برود قبل 2 مل على مدت
- إضافة 5 مل/ز (20% w/v) من المخزن المؤقت المثلج الملح منخفضة (LS) مع 1 × مثبطات البروتياز والفوسفاتيز كوكتيل.
- هوموجينيزي أنسجة المخ على الجليد باستخدام حوالي 10 السكتات الدماغية التخليص عالية مدقة أ والسكتات الدماغية 15 من تطهير منخفض مدقة باء
- نقل جميع هوموجيناتي إلى أنبوب البولي بروبيلين 2 مل استخدام زجاج ماصة باستور. قم بتسمية الأنبوب مع “ ال ” (مجموع هوموجيناتي)، الأنسجة القضية وعدد هوموجيناتي حجم. قاسمة 0.8 مل في أنبوب مسمى 1.5 مل. يمكن أن يكون أي هوموجيناتي الزائدة وبالمثل اليكووتيد والمخزنة في-80 درجة مئوية.
- لكل مل 0.8 الكوة، إضافة 100 ميليلتر من كل 5 م كلوريد الصوديوم وساركوسيل 10% (w/v) إلى تركيزات 0.5 M و 1% w/v، على التوالي. مزج الأنابيب جيدا بانعكاس واحتضان على الجليد لأنابيب تسمية 15 دقيقة مع " ال-S " (مجموع هوموجيناتي-ساركوسيل) تشير إلى هوموجيناتيس في ساركوسيل-المخزن المؤقت (الجدول 1).
- Sonicate كل أنبوبة لنبضات ق 5 ثلاث في السعة 30% على الجليد (أقصى شدتها = 40%) باستخدام مسبار ميكروتيب.
- تحديد تركيزات البروتين هوموجيناتيس استخدام حمض بيسينتشونينيك (اتفاق التعاون الأساسي) الاعتداء 25 الأسلوب.
ملاحظة: يتم تركيز البروتين متوسط هوموجيناتيس ال ق أعد في مل 5 ليرة سورية كل غرام من النسيج 15-20 ملغ/مل. يمكن مجزأ مباشرة هوموجيناتيس أو تخزينها في-80 درجة مئوية حتى استخدام. - Homogenates تمييع TH-S إلى 10 ملغ/مل باستخدام المخزن المؤقت لسارك المثلج (الجدول 1) مع 1 × مثبطات البروتياز والفوسفاتيز. بروتين
- نقل 5 ملغ (0.5 مل) من كل هوموجيناتي دا ال 500 ميليلتر البولي أولتراسينتريفوجي أنابيب وزوج-التوازن مع المخزن المؤقت سارك. تحميل أنابيب إلى الدوار قبل مبردة وأولتراسينتريفوجي في س 180,000 ز لمدة 30 دقيقة في supernatants نقل للذوبان ساركوسيل درجة مئوية. 4 (S1) إلى أنابيب 1.5 مل وتخزينها في-80 درجة مئوية.
ملاحظة: (أغسل اختياري) إضافة 200 ميليلتر لسارك-المخزن المؤقت إلى أولتراسينتريفوجي الأنابيب التي تحتوي على كسور تستعصي على الحل المنظفات (P1) وإزاحة الكريات (P1) من الجزء السفلي من الأنابيب أولتراسينتريفوجي استخدام تلميح ماصة 200 ميليلتر.
أنابيب - بإيجاز نبض-تدور المقلوب ل s 2-3 (≤ 2,500 ز س) في ميكروسينتريفوجي لنقل الكريات (P1) والعازلة للأنابيب 1.5 مل أدناه. ريسوسبيند الكريات (P1) غير قابلة للذوبان في سارك-المخزن المؤقت قبل بيبيتينج صعودا وهبوطاً لضمان تعطل بيليه.
- زوج-التوازن، وأجهزة الطرد المركزي في 180,000 س ز 30 دقيقة إضافية في 4 ° C.
- تجاهل المادة طافية يغسل الاختياري (S2) واحتضان الكريات تستعصي على الحل ساركوسيل (P2) في 50-75 ميليلتر من اليوريا المخزن المؤقت (الجدول 1) مع 1 × الموافقة المسبقة عن علم (مثبط البروتياز والفوسفاتيز كوكتيل) لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة جعل بيليه-
ملاحظة: اليوريا الحارة المخزن المؤقت إلى درجة حرارة الغرفة قبل استخدامها لتجنب ترسيب الحزب الديمقراطي الصربي. تطبيقات حساسة للمنظفات، تجاهل الحزب الديمقراطي الصربي من المخزن المؤقت لليوريا وتنظر الغسيل بيليه (P2) غير قابلة للذوبان في المخزن المؤقت الملح منخفضة قبل ريسوسبيندينج في المخزن المؤقت لليوريا. - نقل الكريات ريسوسبينديد (P2) إلى أنابيب 0.5 مل واستخدام موجز (1 s) سونيكيشن ميكروتيب في السعة 20% (أقصى شدتها = 40 ٪) جعل كامل الكريات.
- تحديد تركيزات بروتين قابل للذوبان ساركوسيل (S1)-والاعتداء الكسور (P2) غير قابلة للذوبان في اتفاق التعاون الأساسي باستخدام الأسلوب. استخدم هذه الكسور مباشرة أو تخزينها في-80 درجة مئوية حتى استخدام.
2. إيمونوبلوتينج
- النشاف الغربية
ملاحظة: النشاف الغربية أجرى وفقا لإجراءات الإبلاغ عنها سابقا مع تعديلات طفيفة. 5 ، 10- إعداد 40 ميكروغرام عينات من مجموع هوموجيناتيس (TH-S) وسارك القابلة للذوبان (S1) وتستعصي على الحل سارك الكسور (P2) في المخزن المؤقت للعينة X لايملي الحزب الديمقراطي الصربي صفحة 1 مع 5 مم تسيب الأس الهيدروجيني 7. احتضان عينات من 95 درجة مئوية للحد الأدنى 5 هلام
- تحميل عينات في الخرسانة الجاهزة 10-جيدا 4-12% مكررا-تريس الحزب الديمقراطي الصربي صفحة. اليكتروفوريسي في 80 الخامس للسنتيمتر الأول (10 دقيقة) و 120 الخامس للفترة المتبقية (60 دقيقة) أو حتى صبغ تتبع تصل إلى الجزء السفلي من الجل.
- استخدام شفرة حلاقة جديدة وجل السكين إلى سبليت--فتح كاسيت جل مسبقة الصب. قص بلطف بعيداً الامشاط وأسفل جداً من الجل مع شفرة حلاقة جديدة-
- ريسوسبيند غير قابلة للذوبان الكريات (P1) في 200 ميليلتر سارك-المخزن المؤقت مع x 1 الموافقة المسبقة عن علم قبل بيبيتينج أعلى وأسفل.
- نقل إلى غشاء النيتروسليلوز 0.2 ميكرون باستخدام أسلوب نقل جافة على جهاز بلوتينج (انظر الجدول المواد)-
- كتلة الغشاء في حجب المخزن المؤقت (بب) دون توين 20 لمدة 30 دقيقة، تلت مع BB مع 0.05% 20 توين (BB/تي) لمدة 30 دقيقة. وبعد تجميد، شطف الغشاء في تبس/تي (0.1% 20 توين) لمدة 5 دقائق لإزالة المخزن المؤقت حظر الزائدة.
- تحضير 1:1,000 تخفيف من pT231 الأجسام المضادة الأولية، وتاو-2 (عموم تاو)، AT8 و EEA1 في BB/T (توين 0.05% 20)-
- احتضان الأغشية في حل جسم الأولية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية مع الانفعالات دائرية. شطف الغشاء في تبس/تي ل 3 × 15 دقيقة
- مسبار الغشاء مع إضعاف 1:20,000 المسمى فلوريسسينتلي قرب الأشعة تحت الحمراء الثانوية جسم في BB/تي لمدة 60 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام على شاكر. شطف الغشاء 3 × 10 دقيقة في تبس/T ودقيقة 2 × 5 في tbs.
- مسح الغشاء باستخدام الأشعة تحت حمراء التصوير النظام في الطول الموجي الإثارة المناسبة (مثلاً 700 نانومتر (القناة الحمراء) للأشعة تحت الحمراء صبغ 680 الماعز الماوس المضادة مفتش (H + L) الثانوي و 800 نانومتر (قناة الأخضر) لصبغ الأشعة تحت الحمراء 790 حمار الأرنب المضادة IgG (H + L ) ثانوي)-
- استخدام برامج التصوير لقياس كثافة الإشارات وإجراء القياسات قياس كثافة حسب الشركة المصنعة ' تعليمات s، تأمين السيارات-خلفية الإعداد يتم تعيين إلى متوسط الخلفية كاملة-
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
تم استخدام البروتوكول يختصر خطوة واحدة ساركوسيل-تجزئة لإثراء المجاميع البروتين تستعصي على الحل المنظفات من التحكم والإعلانية تشريح الجثة الدماغ (الشكل 1). تم حل البروتينات من الكسور TH-S، S1، S2 و P2 بصفحة الحزب الديمقراطي الصربي، ثابتة لمدة 15 دقيقة في أخذ المخزن المؤقت مثبت الأزرق متبوعاً تلطيخ لطيف مع "أخذ الأزرق الرائعة" G-250 المصبوغة المخزن المؤقت. الخطوة استثارة اختيارية نظراً لوجود مستويات غير قابلة للكشف للبروتين في الكسر S2 (انظر 1.1.14). تحليل لطخة غربية (الشكل 2A و ب) يبين بوضوح أن في الدماغ الإعلانية، والمجاميع باثولوجي تاو فوسفوريلاتيد عالية الوزن الجزيئي ساركوسيل-تستعصي على الحل، وتو القليل جداً لا تزال في الكسور ساركوسيل القابلة للذوبان. 5 , 6 , 7 , 8 , 10 , 22 على العكس من ذلك، غالبية تو في الدماغ التحكم مقسمة إلى الكسر ساركوسيل القابلة للذوبان. 5 , 6 , 10 وفي المقابل، EEA1 أساسا للأقسام إلى الكسر S1 في السيطرة والدماغ الإعلانية (الشكل 2). وهنا EEA1 بمثابة علامة عامة لمعظم السكان الأصليين، وغير مرضية من البروتينات التي هي أصلاً للذوبان ساركوسيل5. جدير بالذكر أن هناك إشارة أقل قليلاً ل EEA1 في الكسر القابلة للذوبان (S1) مقارنة بالكسر، ق ال، مشيراً إلى أن مجموعة صغيرة من EEA1 المحتمل ساركوسيل--غير قابلة للذوبان، بعد أقل من حد الكشف بواسطة لطخة غربية مع هذا جسم معين. ونفس القدر الممكن أن الانخفاض الطفيف في قوة الإشارة من EEA1 في الأجزاء القابلة للذوبان (S1) سبب الربط غير محددة من EEA1 للأنابيب أولتراسينتريفوجي يمكن أن تفسر أيضا انحراف طفيف عن النتائج المتوقعة.
لقياس مدى فعالية البروتوكول يختصر خطوة واحدة تجزئة (الشكل 3A) ضد منهجية تجزئة متسلسلة متعددة خطوة أكثر تقليدية (الشكل 3B)، المستويات النسبية تستعصي على الحل ساركوسيل بروتين اميلويد السلائف (APP)، تاو (مات)، ريبونوكليوبروتين النووية الصغيرة U1-70 ك (snRNP70) والابوليبوبروتين ه (الذين) كانت مقارنة بالبروتينات خالية من تسمية الكتلي (MS) على أساس عبر التحكم المجمعة (Ctl)، ضعف الإدراك الخفيف (MCI) والإعلان حالات من7،الدراسات السابقة18 (الشكل 3). فعالية تمثل قياسات للتطبيق المنظفات الذوبان الببتيد Aβ، كجميع الببتيدات التطبيق الكامل تريبتيك الكمية المعينة إلى منطقة Aβ من البروتين بقايا التطبيق كامل طول 6957. مع كلا الأسلوبين، مستويات تستعصي على الحل ساركوسيل من جميع البروتينات باثولوجي أربعة اتجاها صعودا في الحالات MCI والإعلان بالنسبة لعناصر التحكم، اتساقا مع علاقة قوية من التدهور المعرفي والأعباء المرضية. عموما، إثراء هذه البروتينات في كسور تستعصي على الحل المنظفات (P2) تتفق وملحوظ باستخدام كل من خطوة واحدة18 وتجزئة الخطوة متعددة البروتوكولات7.
ومع ذلك، هناك اختلافات طفيفة بين المنهجيتين قد تكون مفيدة أو ضارة تبعاً لطبيعة وأهداف التجربة الفردية. يجوز إبلاغ البيانات المقارنة البروتين تلخيصها في الشكل 3 أي بروتوكول لاستخدامه تبعاً لمعايير تجريبية محددة والتطبيقات. وكما قد يتوقع المرء، هناك مفاضلة عامة بين نموذج الإثراء والنقاء، مع البروتوكول تجزئة مبسطة بمنح أكثر من عينات المخصب مع فقدان البروتين أقل من أسلوب متعدد خطوة.
على سبيل المثال، يحمل كسور غير قابلة للذوبان التحكم المعدة باستخدام البروتوكول مبسطة (الشكل 3A) مستويات الخلفية أعلى قليلاً من البروتينات ذات الصلة بالمرض من تلك التي أعدت عن طريق نهج الخطوة متعددة. على العكس من ذلك، قد يكون مفيداً للبروتينات المنخفضة-وفرة التقنية وجود خطوة واحدة كالعينة الإجمالية يتم تخفيض الخسائر إلى حد كبير. على سبيل المثال، إثراء النسبي للذين ساركوسيل الذوبان في الحالات MCI أعلى بكثير في الكسور غير قابلة للذوبان أعدت عن طريق بروتوكول مختصر (الشكل 3أ).
على الرغم من أن كلا النهجين أكثر من كافية لمراقبة أي زيادة كبيرة في المجاميع البروتين تجمعات ذات الصلة بالمرض أو باثولوجي، أكثر عددا، وتجزئة واسعة النطاق، وخطوات الغسيل نهج الخطوة متعددة قد تولد نظافة وأكثر تحديداً البروتين التوقيع. ومع ذلك، لدينا بيانات التحقق من أن أسلوب تجزئة خطوة واحدة متسقة مع النتائج المنشورة أن المجاميع باثولوجي مثل التشابك neurofibrillary تاو (NFTs) ولويحات Aβ والبريونات الرعاش (PrSc) غير قابلة للذوبان في ساركوسيل، بينما نظيراتها مطوية أصلاً تظل قابلة للذوبان. 5 , 6 , 7 , 8 , 10 , 11 , 23 , 26
عن طريق حساب كميات البروتين النسبية التي تقسيم إلى كسور المنظفات تستعصي على الحل للتحكم (n = 3) والإعلان (n = 3) الدماغ (الجدول 2)، إلا ~ 10% تجمع مجموع البروتين تستعصي على الحل ساركوسيل. عندما مجموع البروتين 5 ملغ للدماغ هوموجيناتي (TH-S) هو مجزأ، 10.4 في المائة و 11.3 في المائة من البروتين الأقسام إلى الكسر المنظفات الذوبان في القضايا الإعلانية، والسيطرة على التوالي. على الرغم من أن المبلغ الإجمالي للبروتين تستعصي على الحل ساركوسيل أثري في الدماغ الإعلانية أعلى بقليل من التحكم، لا توجد اختلافات كبيرة لوحظت عبر هاتين المجموعتين (p = 0.703). وهذا يشير إلى أن ميسفولدينج البروتين والتجميع ليس على نطاق واسع في الدماغ الإعلانية، ولكن بدلاً من ذلك تقتصر على مجموعة فرعية ضيقة ومحددة من البروتينات مثل تاو، Aβ و U1 سنرنبس. 7 , 21 , 22
رقم 1: مخطط تجزئة ساركوسيل. وكان تجانس المخ البشري تشريح الجثة (A) A في المخزن المؤقت الملح منخفضة، إضافة إلى تركيزات النهائي من 1% w/v و 0.5 م، على التوالي والمحتضنة لمدة 15 دقيقة على الجليد بعد ذلك ساركوسيل وكلوريد الصوديوم. بعد سونيكيشن، كان مجزأ homogenates واسطة تنبيذ فائق في 180,000 ز س مدة 30 دقيقة تكفل المادة طافية ساركوسيل القابلة للذوبان (S1) وبيليه تستعصي على الحل ساركوسيل (P1). كان غسلها بيليه P1 (اختيارياً) مع سارك-المخزن المؤقت وإعادة رسابة تنبيذ فائق تحمل بيليه ساركوسيل-تستعصي على الحل النهائي (P2). وكان سولوبيليزيد هذا الكسر P2 في المخزن المؤقت لليوريا لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة، تليها sonication s 3 × 5 مع تحقيق ميكروتيب نظيفة. (ب) البروتينات (20 ميكروغرام) من ال-S، S1، S2 (10 ميليلتر) وتم حل الكسور P2 بصفحة الحزب الديمقراطي الصربي، ثابتة لمدة 15 دقيقة في أخذ المخزن المؤقت مثبت الأزرق متبوعاً تلطيخ لطيف مع "أخذ الأزرق الرائعة" G-250 المصبوغة العازلة بين عشية وضحاها في درجة حرارة الغرفة. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.
رقم 2: إثراء تاو فوسفوريلاتيد في الجزء غير قابل للذوبان المنظفات الدماغ الإعلانية. (أ و ب) البروتين (40 ميكروغرام) من المجموع (TH-S)، تم مسح (S1) القابلة للذوبان وغير قابلة للذوبان (P2) الكسور مع جسم مضاد ضد تاو فوسفوريلاتيد في ثريونين 231 (pT231) أو AT8 (pSer202، pThr205) لإظهار ثراء الأنواع تاو والرمات باثولوجي في جزء غير قابل للذوبان (P2) من الدماغ الإعلانية. في الدماغ الإعلانية، وتجميع عالية الوزن الجزيئي تاو حصرا من الأقسام إلى الكسر (P2) المنظفات تستعصي على الحل. (ج) EEA1 بمثابة علامة بروتين قابل للذوبان والتحكم تحميل النسبي لمجموع (TH-S) والكسور (S1) القابلة للذوبان للتحكم والدماغ الإعلانية. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
رقم 3: تحليل البروتين باثولوجي الإعلانية البروتينات باستخدام بروتوكول تجزئة خطوة واحدة أو متعددة الخطوات. المستويات النسبية للبروتينات تستعصي على الحل ساركوسيل الممثل التطبيق (Aβ)، تاو، snRNP70 (70 ك-U1) والذين عبر مختلف الأمراض بين تجميع عنصر تحكم، حالات MCI والإعلانية باستخدام خطوة واحدة () أو متعدد خطوة (ب) ساركوسيل تجزئة النهج. لكل مجموعات البيانات، قدرت مستوى البروتين الببتيد الطيفية مباريات (النظام) هذه البروتينات، وتطبيع لتعيين الحد الأقصى إلى 100. النظام من قضايا الرقابة ووزارة التجارة والصناعة الإعلانية (n = 5 كل) كانت تستخدم dataset مجموعة واحدة. لنهج الخطوة متعددة، النظام من اثنين من مجمعات نسخ متماثل لعنصر التحكم، حالات MCI والإعلانية (n = 5 كل) حللت. أشرطة الخطأ تشير إلى القيم ± يعني S.E.M. الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-
| 10% w/v ساركوسيل الحل: 10 جرام ساركوسيني-N-دوديسيل ملح الصوديوم في 100 مل من ddH2س (ضجة في الرايت بين عشية وضحاها) |
| المخزن المؤقت منخفضة الملح (LS): 50 مم حبيس pH 7.0 أو السكروز 250 ملم، يدتا 1 مم |
| ساركوسيل (سارك) المخزن المؤقت: المخزن المؤقت LS + ساركوسيل 1% (w/v) + 0.5 م كلوريد الصوديوم |
| اليوريا المخزن (مخزن في-20 درجة مئوية): 50 مم تريس-HCl pH 8.5، اليوريا م 8، 2% الحزب الديمقراطي الصربي |
| المخزن المؤقت لتحميل الحزب الديمقراطي الصربي X 4: 200 ملم تريس-HCl الأس الهيدروجيني 6.8، والغليسيرول 40%، 8% الصوديوم دوديسيل سوفلاتي (الحزب الديمقراطي الصربي)، 0.4% بروموفينول الأزرق (BPB) وعيار 20 ملم تسيب pH 7.0 في ddH2س |
| أخذ مثبت المخزن المؤقت: 40 ٪ الميثانول، 10% حمض الخليك في ddH2س |
| G-250 "أخذ الرائعة الزرقاء" المصبوغة المخزن المؤقت: 25 ٪ الميثانول، وحامض الخليك 5%، 0.1% أخذ الأزرق G-250 في ddH2س |
| أخذ ديستاين المخزن المؤقت: 25 ٪ الميثانول، حامض الخليك 5% في ddH2س |
| 1 X Tris مخزنة المالحة (تبس): 50 مم تريس-HCl الأس الهيدروجيني 7.45، 150 مم كلوريد الصوديوم في ddH2س |
| 1 الملحية X Tris مخزنة مع 20 توين (تبس/T): 50 مم تريس-HCl الأس الهيدروجيني 7.45، 150 مم كلوريد الصوديوم، 0.1% توين ddH في 202س |
| 1 X حجب المخزن المؤقت (BB): 50 مم تريس-HCl الأس الهيدروجيني 7.45، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1% بروتين الملكية (انظر قائمة المواد)، 750 مم ميثيلتشلورويسوثيازولينوني في ddH2س |
| 1 X حجب المخزن المؤقت مع 0.05% 20 توين (BB/T): 50 ملم تريس-HCl الأس الهيدروجيني 7.45، 150 مم كلوريد الصوديوم، 1% بروتين الملكية (انظر قائمة المواد)، 0.05% 20 توين، 750 مم ميثيلتشلورويسوثيازولينوني في ddH2O |
الجدول 1: قائمة المخازن المؤقتة.
| عينة | حجم العينة (ميليلتر) | تركيز (ميكروغرام/ميليلتر) | مجموع البروتين (ميكروغرام) | متوسط مجموع البروتين (ميكروغرام) و S.E.M. | % ال-S (5 ملغ) |
| Ctl 1 | 70 | 9.89 | 692.3 | ||
| Ctl 2 | 70 | 7.38 | 516.6 | 518.7 (±99.63) | 10.4 في المائة |
| Ctl 3 | 70 | 4.96 | 347.2 | ||
| 1 الإعلانية | 70 | 9.77 | 683.9 | ||
| 2 الإعلانية | 70 | 6.67 | 466.9 | 567.0 (±63.20) | 11.3 ٪ |
| 3 الإعلانية | 70 | 7.86 | 550.2 |
الجدول 2: كمية البروتين في الكسور تستعصي على الحل ساركوسيل (P2)- في المتوسط، النسبة المئوية للبروتين لأن الأقسام إلى الكسر تستعصي على الحل ساركوسيل لعنصر التحكم (n= 3) والإعلان (n= 3) كان الدماغ 10.4 في المائة و 11.3 في المائة على التوالي. أنه لا فرق يعتد به إحصائيا من مقدار البروتينات تستعصي على الحل ساركوسيل من التحكم والدماغ الإعلانية، كما يدل على ذلك من الطالب t-اختبار (p = 0.703) والخطأ المعياري لقيم يعني (S.E.M.).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
هنا يمكننا إدخال ومناقشة بروتوكول المنظفات-تجزئة خطوة واحدة مختصرة التي تنطبق على مجموعة متنوعة من تطبيقات تجريبية تتراوح بين التحليل الشامل القائم على قياس الطيف الكتلي البروتيوميات البروتين وظيفية misfolding فحوصات والنشاف الغربية. 5 , 6 , 7 , 10 هذه المنهجية ربما معظم فعالة عند استخدامها لدراسة بروتينوباثيس الأعصاب مثل الزهايمر والمرض، مرض هنتنغتون، أمراض بريون وتاوباثيس المختلفة. بالمقارنة مع الأصلي للبروتوكول وجود خمس خطوات متتابعة، هذا الإجراء خطوة واحدة يمكن أن تكتمل في يوم واحد وتتيح نتائج مشابهة جداً. 5 , 6 , 7 , 9 , 14 , 22
جانبا مهما من هذا البروتوكول هو استخدام ساركوسيل كمواد التنظيف تجزئة. على النقيض من المنظفات الأخرى مثل Triton X-100 أو الصوديوم دوديسيل كبريتات (SDS)، يظهر ساركوسيل لتكون مناسبة تماما لهذه المهمة؛ فيما يتعلق بصرامة وقوة سولوبيليزينج، أنها قوية بما يكفي جعل معظم البروتينات مطوية أصلاً مع الحفاظ على المنظفات-إينسولوبيليتي، وهيكل ووظيفة المجاميع البروتين الأمراض ذات الصلة التي أصلاً الحساسة للحزب الديمقراطي الصربي. 5 , 9 بالإضافة إلى ذلك، خلافا للحزب الديمقراطي الصربي، ساركوسيل ما زالت قابلة للذوبان عند درجات حرارة منخفضة وفي ظروف الملح عالية.
هناك سمة رئيسية أخرى من هذا البروتوكول هو استثارة الكريات (P1) ساركوسيل-تستعصي على الحل الأول عقب الأول من تنبيذ فائق. تسمح هذه الخطوة يغسل الكريات الأولية (P1) دقة استخراجه وغسلها من أي الصليب-تلويث بقايا هوموجيناتي القابلة للذوبان أو مجموع البروتينات، إتاحة جزء صغير بروتين تستعصي على الحل المنظفات نقية وواضحة المعالم. دون خطوة اختيارية بيليه (P1) استثارة، والمياه والصرف الصحي، البروتينات القابلة للذوبان المتبقية قد تكون إجراء أكثر إلى الكسر المنظفات تستعصي على الحل، ربما الخلط النتائج اللاحقة والتجارب (أي تحليل إيمونوبلوتينج أو البروتيوميات).
طبيعة الوزن الجزيئي غير قابلة للذوبان وعالية البروتين تجمعات باثولوجي المجاميع (أي تاو، والرمات-تاو والأنواع Aβ) تحديات فريدة من نوعها الحالية نحو العزلة وتحليلها عن طريق التقنيات الحيوية التقليدية. 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 12 , 17 , 21 , 26 على عكس البروتينات القابلة للذوبان، المجاميع غير قابلة للذوبان مثل أميلويدس (Aβ) ولا يمكن أن هايبرفوسفوريلاتيد تاو neurofibrillary التشابك (NFTs) سهولة المنقي من الأنسجة تشريح الجثة بالطرق التقليدية مثل إيمونوبريسيبيتيشن أو سريعة البروتين اللوني السائل (فبلك). 3 , 5 , 6 , 7 , 11 , 12 , 23 , 27 هكذا، تجزئة ساركوسيل المختصر البروتوكول هو أحد الأساليب الوحيدة التي تسمح لتخصيب اليورانيوم السطحية والعزلة من المجاميع البروتين تستعصي على الحل المنظفات من الدماغ تشريح الجثة داخل نسبيا-زمني قصير. 5 , 6 , 8 , 13 , 15 , 17 , 21 , 27
بينما خطوات إضافية يمكن أن تستخدم لعزل عينة نقية ومتجانسة من البروتين مجمعة، يسمح بروتوكول تجزئة ساركوسيل لإثراء السطحية من المجاميع البروتين تستعصي على الحل المنظفات مع الالتزام بالوقت القليل نسبيا. 5 , 6 تأكيد دراسات البروتين من البروتين تستعصي على الحل ساركوسيل دعما لهذه الفرضية، أن الغالبية العظمى من البروتينات المعرضة لتجميع باثولوجي المعروفة تقسيم إلى ساركوسيل يذوب الكسر في كل خطوة متعددة التقليدية 6 , 11 , 21 فضلا عن نهجنا الرواية خطوة واحدة تجزئة. 5 , 7 , 9 , 10
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
الكتاب ليس لها علاقة بالكشف عن.
Acknowledgments
يشكر المؤلفون الدكتور جيم لاه وليفي الآن، إدارة أموري لطب الأعصاب، اقتراحات وتعليقات مفيدة. تم تمويل هذا العمل جزئيا "التعجيل بالشراكة الطب" المنحة (U01AG046161-02)، مرض الزهايمر أموري لمنح مركز بحوث الأمراض (P50AG025688) والمعهد الوطني الشيخوخة (R01AG053960-01) إلى N.T.S. هذا البحث أيضا تدعمها جزئيا "جوهر" المنحة "أموري علم الأعصاب NINDS المرافق الأساسية"، P30NS055077 أمراض الأعصاب.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Protease and phosphatase inhibitor cocktail, EDTA-free (100X) | Thermo Fisher | 78441 | protease & phosphatase inhibitor cocktail |
| Sonic Dismembrator System (ultrasonicator) | Fisher Scientific | FB505110 | microtip ultrasonicator |
| Optimax TLX Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 361545 | refrigerated ultracentrifuge |
| TLA120.1 rotor | Beckman Coulter | 362224 | ultracentrifuge rotor |
| 500 ul (8 x 34 mm) polycarbonate tubes, thickwall | Beckman Coulter | 343776 | ultracentrifuge tubes for TLA120.1 rotor |
| 4X SDS sample buffer | Home-made | N/A | SDS-PAGE |
| TCEP solution, neutral pH | Thermo Fisher | 77720 | reducing agent |
| (TBS) blocking buffer | Thermo Fisher | 37542 | blocking buffer |
| (TBS) blocking buffer + 0.05% Tween 20 | Thermo Fisher | 37543 | blocking buffer and antibody diluent |
| 4-12% Bolt Bis-Tris Plus gels, 10-well | Thermo Fisher | NW04120BOX | precast SDS-PAGE gels |
| MES SDS Running Buffer (20X) | Thermo Fisher | B0002 | SDS-PAGE running buffer |
| N-Lauroylsarcosine sodium salt (sarkosyl) | Sigma Aldrich | L5777-50G | detergent |
| Anti-Tau-2 (pan tau) antibody | Chemicon | MAB375 | antibodies |
| Anti-phospho-threonine 231 Tau antibody | Millipore | MAB5450 | antibodies |
| Anti-phospho-seroine 202 and threonine 205 Tau antibody (AT8) | Thermo Fisher | MN1020 | antibodies |
| Anti-early endosome antigen 1 (EEA1) antibody | abcam | ab2900 | antibodies |
| Alexa Fluor 680 goat anti-mouse IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher | A21058 | antibodies |
| Alexa Fluor 790 donkey anti-rabbit IgG (H+L) secondary antibody | Thermo Fisher | A11374 | antibodies |
| iBlot2 Dry Blotting System | Thermo Fisher | IB21001 | Gel transfer |
| iBlot2 Transfer Stacks, Nitrocellulose, mini | Thermo Fisher | IB23002 | Gel transfer |
References
- Taylor, J. P., Hardy, J., Fischbeck, K. H.
- Ross, C. A., Poirier, M. A.
- Ramírez-Alvarado, M., Merkel, J. S., Regan, L. A systematic exploration of the influence of the protein stability on amyloid fibril formation in vitro. Proc. Natl. Acad. Sci. 97 (16), 8979-8984 (2000).
- Hamley, I. W. The Amyloid Beta Peptide: A Chemist's Perspective. Role in Alzheimer's and Fibrillization. Chem Rev. 112 (10), 5147-5192 (2012).
- Diner, I., et al. Aggregation Properties of the Small Nuclear Ribonucleoprotein U1-70K in Alzheimer Disease. J. Biol. Chem. 289 (51), 35296-35313 (2014).
- Gozal, Y. M., et al. Proteomics Analysis Reveals Novel Components in the Detergent-Insoluble Subproteome in Alzheimer's Disease. J. Proteome Res. 8 (11), 5069-5079 (2009).
- Hales, C. M., et al. Changes in the detergent-insoluble brain proteome linked to amyloid and tau in Alzheimer's Disease progression. PROTEOMICS. , (2016).
- Julien, C., Bretteville, A., Planel, E. Amyloid Proteins: Methods and Protocols. Sigurdsson, E. M., Calero, M., Gasset, M. , Humana Press. 473-491 (2012).
- Nizhnikov, A. A., et al. Proteomic Screening for Amyloid Proteins. PLoS ONE. 9 (12), e116003 (2014).
- Seyfried, N. T., et al. Quantitative analysis of the detergent-insoluble brain proteome in frontotemporal lobar degeneration using SILAC internal standards. J. Proteome Res. 11 (5), 2721-2738 (2012).
- Woltjer, R. L., et al. Proteomic determination of widespread detergent insolubility, including Aβ but not tau, early in the pathogenesis of Alzheimer's disease. FASEB J. , (2005).
- Miake, H., Mizusawa, H., Iwatsubo, T., Hasegawa, M. Biochemical Characterization of the Core Structure of α-Synuclein Filaments. J. Biol. Chem. 277 (21), 19213-19219 (2002).
- Hasegawa, M., et al. Phosphorylated α-Synuclein Is Ubiquitinated in α-Synucleinopathy Lesions. J. Biol. Chem. 277 (50), 49071-49076 (2002).
- Neumann, M., et al. Ubiquitinated TDP-43 in Frontotemporal Lobar Degeneration and Amyotrophic Lateral Sclerosis. Science. 314 (5796), 130 (2006).
- Bishof, I., Diner, I., Seyfried, N. An Intrinsically Disordered Low Complexity Domain is Required for U1-70K Self-association. FASEB J. 29 (Suppl 1), (2015).
- Braak, H., Braak, E. Neuropathological stageing of Alzheimer-related changes. Acta Neuropathol. 82 (4), 239-259 (1991).
- Noguchi, A., et al. Isolation and Characterization of Patient-derived, Toxic, High Mass Amyloid β-Protein (Aβ) Assembly from Alzheimer Disease Brains. J. Biol. Chem. 284 (47), 32895-32905 (2009).
- Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease. Proc. Natl. Acad. Sci. 110 (41), 16562-16567 (2013).
- Klunk, W. E., Pettegrew, J. W. Alzheimer's β-Amyloid Protein Is Covalently Modified when Dissolved in Formic Acid. J Neurochem. 54 (6), 2050-2056 (1990).
- Yang, L. -S., Gordon-Krajcer, W., Ksiezak-Reding, H. Tau Released from Paired Helical Filaments with Formic Acid or Guanidine Is Susceptible to Calpain-Mediated Proteolysis. J Neurochem. 69 (4), 1548-1558 (1997).
- Bai, B., et al. U1 small nuclear ribonucleoprotein complex and RNA splicing alterations in Alzheimer's disease. Proc Natl Acad Sci U S A. 110 (41), 16562-16567 (2013).
- Hales, C. M., et al. U1 small nuclear ribonucleoproteins (snRNPs) aggregate in Alzheimer's disease due to autosomal dominant genetic mutations and trisomy 21. Mol Neurodegener. 9 (1), 15 (2014).
- Xiong, L. -W., Raymond, L. D., Hayes, S. F., Raymond, G. J., Caughey, B. Conformational change, aggregation and fibril formation induced by detergent treatments of cellular prion protein. J Neurochem. 79 (3), 669-678 (2001).
- Mirra, S. S., et al. The Consortium to Establish a Registry for Alzheimer's Disease (CERAD). Part II. Standardization of the neuropathologic assessment of Alzheimer's disease. Neurology. 41 (4), 479-486 (1991).
- Smith, P. K., et al.
- Guo, J. L., et al. Unique pathological tau conformers from Alzheimer's brains transmit tau pathology in nontransgenic mice. J. Exp. Med. 213 (12), 2635-2654 (2016).
- Matveev, S. V., et al. A distinct subfraction of Aβ is responsible for the high-affinity Pittsburgh compound B-binding site in Alzheimer's disease brain. J Neurochem. 131 (3), 356-368 (2014).
