In vitro dosaggi per valutare la formazione e la rottura del vaso come la barriera emato-cerebrale
Summary
Il mantenimento della copertura della barriera emato-sangue è fondamentale per l'omeostasi del sistema nervoso centrale. Questo protocollo descrive tecniche in vitro per delineare i processi fondamentali e patologici che modulano la copertura della barriera emato-sangue.
Abstract
La copertura del sangue-cervello (BBB) svolge un ruolo centrale nell'omeostasi del sistema nervoso centrale (CNS). Il BBB è mantenuto dinamicamente da astrociti, periciti e cellule endoteliali cerebrali (BECs). Qui metodi dettagliati per valutare la copertura BBB utilizzando singole colture di BEC umani immortalizzati, singole colture di BEC primari del mouse e un modello di coltura triplicata umanizzata (BECs, astrociti e periciti) del BBB. Per evidenziare l'applicabilità dei dosaggi agli stati di malattia, descriviamo l'effetto dell'amyloid oligomerico (oAβ), che rappresenta un importante contributo alla progressione della malattia di Alzheimer (AD), sulla copertura BBB. Inoltre, utilizziamo il fattore di crescita epidermico (EGF) per illuminare il potenziale di screening delle droghe delle tecniche. I nostri risultati mostrano che singole e triple coltivate BECs formano strutture a maglia in condizioni basali e che oAβ interferisce con questa formazione di mesh e degenerizza le strutture preformate di maglie,Ma EGF blocca questa rottura. Quindi le tecniche descritte sono importanti per la dissezione di processi fondamentali e rilevanti per la malattia che modulano la copertura BBB.
Introduction
La barriera emato-cerebrale (BBB) dei capillari cerebrali è la più grande interfaccia del contatto ematico-to-cerebrale e svolge un ruolo centrale nell'omeostasi del sistema nervoso centrale (CNS) 1 , 2 . I processi dinamici del BBB impediscono l'assorbimento di molecole indesiderate dal sangue, rimuovono i prodotti di scarto dal CNS, forniscono nutrienti essenziali e molecole di segnalazione al CNS e modulano la neuroinflammazione 1 , 2 , 3 , 4 , 5 . Il danno di BBB è prevalente durante l'invecchiamento e diversi disturbi neurodegenerativi tra cui la malattia di Alzheimer (AD), la sclerosi multipla e l'ictus 1 , 2 , 3 , 4 , 5 ,Ass = "xref"> 6. Pertanto, la disfunzione di BBB può svolgere un ruolo chiave nei disturbi neurodegenerativi, anche come obiettivo terapeutico.
Il mantenimento della copertura dei recipienti è importante per le funzioni homeostatiche del BBB. Tuttavia, i dati in vivo e in vitro confligano sul fatto che i processi coinvolti nei disturbi neurodegenerativi causino una copertura BBB maggiore o minore 6 , 7 , 8 , 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , particolarmente in AD. Pertanto, vi è una forte logica per lo sviluppo di modelli in vitro utilizzando tipi di cellule per valutare e comprendere in modo più completo le dinamiche della copertura BBB. I capillari cerebrali sono composti da astrociti, periciti e cellule endoteliali cerebrali (BECs) <sUp class = "xref"> 3. Tutti i tipi di cellule contribuiscono alla funzione del BBB attraverso il supporto strutturale e attraverso la secrezione di molecole effector come fattori di crescita angiogenici, citochine e chemiokine che agiscono in modo paracrino e autocrino. Tuttavia, le principali cellule efficaci del BBB sono BECs 3 . In generale, le tecniche di coltura cellulare per la valutazione della funzione BBB sono i test di permeabilità eseguiti su cellule coltivate su inserti di filtri o valutando i livelli di proteine chiave BEC, sia dopo l'aggiunta di stress 14 , 15 , 16 . Sebbene importanti, questi dosaggi non riguardano la copertura cerebrovascolare.
Qui, i nostri precedenti metodi 17 sono dettagliati per valutare la copertura BEC e le strutture di tipo reticolo utilizzando singole colture di BEC umani immortalizzati, singole colture di BEC primari del mouse e una cultura tripla umanizzataModello (BEC, astrociti e periciti) del BBB. L'obiettivo era dimostrare l'effetto dannoso di oAβ, che è considerato un importante contributore alla progressione dell'AD, sulla copertura BEC. L'effetto protettivo del fattore di crescita epidermico (EGF) evidenzia il potenziale della tecnica come strumento di screening terapeutico. La tecnica presenta diverse applicazioni per la ricerca di base e applicata, tra cui: 1) definire il ruolo di percorsi specifici in materia di angiogenesi e copertura dei vasi, 2) valutare gli effetti delle malattie e dei fattori rilevanti sull'invecchiamento sull'angiogenesi e sulla vasca e 3) individuare le attività farmacologiche obiettivi.
Protocol
Representative Results
Discussion
I metodi descritti possono essere utilizzati per affrontare diverse questioni biologiche fondamentali che riguardano la copertura cerebrovascolare24. In particolare, essi possono identificare quali recettori e vie di segnalazione svolgono un ruolo in angiogenesi, la copertura dei recipienti nei tessuti del cancro e cellule endoteliali periferiche rilevanti per il cervello. Gli esempi includono i recettori del fattore di crescita angiogenico, l'ossido nitrico, la mitogen attivata dalla proteina chinasi e la segnalazi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Leon Tai è finanziato da fondi d'avvio di Chicago University of Illinois.
Materials
| hCMEC/D3 cells | Milipore | SCC066 | |
| EBM-2 basal media | Lonza | CC-3156 | |
| Collagen Type 1 | ThermoFisher | A1064401 | |
| HBSS, calcium, magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14025092 | |
| HBSS, no calcium, no magnesium, no phenol red | ThermoFisher | 14175095 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | ThermoFisher | 25200056 | |
| Final concentrations of the SingleQuot growth factor supplements for EBM2 media | Lonza | CC-4147 | |
| 5% FBS | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Ascorbic acid | Lonza | CC-4147 | |
| 10% Gentamycin sulphate | Lonza | CC-4147 | |
| 25% Hydrocortisone | Lonza | CC-4147 | |
| 1/4 volume of the supplied growth factors: fibroblast growth factor, epidermal growth factor, insulin-like growth factor, vascular endothelial growth factor | Lonza | CC-4147 | |
| Puromycin hydrochloride | VWR | 80503-312 | |
| MEM-HEPES | Thermo Scientific | 12360-038 | |
| Papain cell dissociation system (papain and DNase1) | Worthington Biochemical | LK003150 | |
| Human pericytes | Sciencell | 1200 | |
| Pericyte basal media | Sciencell | 1201 | |
| Pericyte growth supplement | Sciencell | 1252 | |
| Human Astrocytes | Sciencell | 1800 | |
| Astrocyte media | Sciencell | 1801 | |
| Astrocyte growth supplement | Sciencell | 1852 | |
| Basement membrane (Matrigel Growth Factor Reduced) | Corning | 356231 | |
| Angiogenesis m-plates (96-well) | ibidi | 89646 | |
| Human Epidermal growth factor | Shenendoah Biotechnology | 100-26 | |
| CellTracker green | ThermoFisher | C7025 | |
| CellTracker orange | ThermoFisher | C34551 | |
| CellTracker blue | ThermoFisher | C2110 | |
| Poly-l-lysine | Sciencell | 0403 | |
| 10% Neutral Buffered Formalin | Sigma-Aldrich | HT5012-60ML | |
| C57BL mice | Jackson Laboratory | na | |
| PCR tube strips | GeneMate | T-3014-2 | |
| Zeiss stereo discover v.8 dissecting microscope | Zeiss | na |
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