Das invertierte Herzmodell für interstitielle Transudat-Sammlung aus dem isolierten Rattenherz
Summary
Dieses Protokoll beschreibt eine Methode, um kardiale interstitielle Flüssigkeit aus dem isolierten, perfundierten Rattenherz zu sammeln. Um das interstitielle Transudat aus dem koronaren venösen Abwässer-Perfusat körperlich zu trennen, wird das Langendorff-Perfundherz umgekehrt, und das auf der Herzoberfläche gebildete Transudat (interstitielle Flüssigkeit) wird mit einer weichen Latexkappe gesammelt.
Abstract
Das vorliegende Protokoll beschreibt einen einzigartigen Ansatz, der die Sammlung von Herz-Transudat (CT) aus dem isolierten, salz-perfundierten Rattenherz ermöglicht. Nach der Isolierung und retrograden Perfusion des Herzens nach der Langendorff-Technik wird das Herz in eine umgekehrte Position umgekehrt und wird durch einen in den linken Ventrikel eingeführten Ballonkatheter mechanisch stabilisiert. Dann wird eine dünne Latexkappe, die zuvor auf die durchschnittliche Größe des Rattenherzens abgestimmt ist, über die Epikardoberfläche gelegt. Der Auslaß der Latexkappe ist mit dem Silikonschlauch verbunden, wobei die distale Öffnung 10 cm unterhalb des Grundniveaus des Herzens liegt und eine leichte Absaugung erzeugt. CT, das kontinuierlich auf der Epikardoberfläche erzeugt wird, wird in eisgekühlten Fläschchen zur weiteren Analyse gesammelt. Die Rate der CT-Bildung reichte von 17 bis 147 μl / min (n = 14) in Kontroll- und Infarktherzen, was 0,1-1% des koronaren venösen Abwassersperfusats entspricht. Proteomische Analyse und hohe PerfoRmance liquid chromatography (HPLC) zeigte, dass die gesammelte CT ein breites Spektrum an Proteinen und purinergischen Metaboliten enthält.
Introduction
Herzinsuffizienz (HF) ist die führende Todesursache bei Menschen weltweit 1 . HF tritt häufig wegen der Myokarditis, der ischämischen Beleidigung des Myokards und der linksventrikulären Remodelierung auf, was zur fortschreitenden Verschlechterung der kontraktilen Herztierfunktion und der Lebensqualität der Patienten führt. Obwohl Fortschritte in der Kardiologie und Herzchirurgie die HF-Sterblichkeit merklich gesenkt haben, dienen sie lediglich als vorübergehende "Verzögerer" eines unvermeidlich fortschreitenden Krankheitsprozesses, der eine signifikante Morbidität aufweist. Daher unterstreicht der derzeitige Mangel an wirksamer Behandlung die Notwendigkeit, neuartige molekulare Ziele zu identifizieren, die HF verhindern oder sogar umkehren können. Dazu gehören Veränderungen in der extrazellulären Matrix, unkontrollierte Herz-Immunantwort und Wechselwirkungen zwischen Herz- und Nicht-Herz-Zellen 2 .
Es ist wichtig zu erkennen, dass die Mikroumgebung, die Herzzellen ausgesetzt sindUm die Immun- und Regenerationsreaktion des verletzten Herzens zu formen. In dem isolierten, salzperfundierten Herz wird CT auf der Herzoberfläche in Form von kleinen Tröpfchen erzeugt, die aus dem interstitiellen Fluidraum ( dh Mikroumgebung), sowohl unter physiologischen als auch pathophysiologischen Bedingungen 3 , 4 , 5, abgeleitet sind . Daher kann die Analyse der CT ( dh interstitielle Flüssigkeit) dazu beitragen, Faktoren zu identifizieren, die den Herzmetabolismus und die kontraktile Funktion 6 regulieren oder die Immunzellenfunktionen nach der Migration in das verletzte Herz beeinflussen. Potenziell kann dies zur Entwicklung neuartiger therapeutischer Strategien zur Behandlung von HF führen.
Die Sammlung von CT aus murinen Herzen ist technisch anspruchsvoll. In regelmäßigen Langendorff-perfundierten Herzen ist die exklusive CT-Sammlung schwierig, weil die Mischung der CT mit CoronarY venöse Abwässerperfusate verdreht unvorhersehbar jede Konzentration von Metaboliten / Enzymen, die aus dem interstitiellen Raum freigesetzt werden. Eine mögliche Strategie, diese Einschränkung zu überwinden, besteht darin, den venösen Abfluss durch Kanülen des Pulmonals auszuschließen und gleichzeitig die Lungenvene zu lenken 7 . Diese Methode steht jedoch vor Schwierigkeiten, die mit der Kanülierung und Ligation der Pulmonalarterie und der Vene verbunden sind, was ein potentielles Auslaufen von venösen Abwässern in das Herztransudat verursacht. Das Konzept der Verwendung eines umgekehrten Herzmodells wurde zuerst von der Gruppe von Kammermeier eingeführt, die das isolierte, perfundierte Herz in eine umgekehrte Position umwandelte und eine dünne Latexkappe auf die Epikardoberfläche legte, um kontinuierlich CT ohne die Verunreinigung des venösen Abwassers abzutasten 8 , 9 Unter Verwendung dieses Verfahrens zeigte CT eine sehr empfindliche Messung der aus dem Herzen 9 freigesetzten Metaboliten,Die Kapillartransfer von Fettsäuren 8 und die Viruspartikel 10 .
In jüngster Zeit wurden parakrine Faktoren, die die lokale Immunantwort regulieren und die Herzangiogenese 11 erhöhen können, in die vorteilhaften Wirkungen einer Stammzell-Therapie auf Herzerkrankungen verwickelt. Die Analyse der CT im umgekehrten Herzen kann dazu beitragen, diese einzelnen parakrinen Faktoren chemisch zu identifizieren. Darüber hinaus kann CT helfen, die Faktoren, die bei der in vivo Aktivierung von Immunzellen im Herzen beteiligt sind, zu identifizieren.
Die detaillierte Beschreibung der CT-Sammlung von der Herzoberfläche, die hier zur Verfügung gestellt wird, ist experimentell nützlich für Forscher, die das Zusammenspiel von Immunzellen, Fibroblasten, Endothelzellen und Kardiomyozyten im Zusammenhang mit der Gesamt-Herzfunktion untersuchen. Wie oben erwähnt, trägt die interstitielle Flüssigkeit die Information für die Zell-zu-Zell-Kommunikation innerhalb des Herzens, whIch kann bequem durch die Sammlung von CT beurteilt werden. Die ausführliche technische Beschreibung, einschließlich eines Videoprotokolls, wie man CT aus dem umgekehrten Herzen sammelt, sollte die zukünftige Anwendung dieser einzigartigen Technik erleichtern.
Protocol
Representative Results
Discussion
Das umgekehrte Herzmodell basiert auf der etablierten Langendorff-Herzperfusionstechnik 12 und wird durch einfaches Invertieren des Herzens in eine umgekehrte Position und Halten dieser Position unter Verwendung eines starren intraventrikulären Ballonkatheters durchgeführt. Auf diese Weise kann das kardiale interstitielle Transudat physisch von dem koronaren venösen Abflussperfusat getrennt werden, das durch die Schwerkraft von der Basis des Herzens 9 tropft. Die CT kan…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Studie wurde gefördert von NSFC 81570244, FoKo 23/2013 und SFB 1116 / B01 und vom Herz-Kreislauf-Forschungsinstitut Düsseldorf (CARID).
Materials
| Latex Solution | ProChemie | Z-Latex LA-TZ | http://kautschukgesellschaft.de/%E2%80%A8z-latexla-tz%E2%80%A8 |
| Aluminum Mold | Home made | – | Reverse heart model |
| Universal Ovens | Memmert | UNB 400 | Reverse heart model |
| Latex Balloon | Hugo Sachs | Size 4 | Reverse heart model |
| Milling Machine | Proxxon | MF70 | Reverse heart model |
| Sodium Chloride | Sigma | SZBD0810V | Chemicals |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Roth | 68852 | Chemicals |
| Potassium Chloride | Merck | 49361 | Chemicals |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | Merck | 58861 | Chemicals |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Merck | 48731 | Chemicals |
| D(+)-Glucose Anhydrous | Merck | 83371 | Chemicals |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fluka | 21097 | Chemicals |
| Balance | VWR | SE 1202 | Weighing chemicals |
| Double Distilled Water | Millpore | – | Disolving chemicals |
| Medical Pressure Transducer | Gold | – | Langendorff apparatus |
| Medical Flow Probe | Transonic | 3PXN | Langendorff apparatus |
| Heating Circulating Bath | Haake | B3 ; DC1 | Langendorff apparatus |
| Laboratory and Vaccum Tubing | Tygon | R-3603 | Langendorff apparatus |
| Animal Research Flowmeters | Transonic | T206 | Langendorff apparatus |
| PowerLab Data Acquisition Device | AD Instruments | Chart 7.1 | Langendorff apparatus |
| LabChart Data Acquisition Software | AD Instruments | Chart 7.1 | Langendorff apparatus |
| Peristaltic Pump | Glison | MINIPULS 3 | Langendorff apparatus |
| Glass Water Column | home made | – | Langendorff apparatus |
| Water Bath Protective Agent | VWR | 462-7000 | Langendorff apparatus |
| Sterile Disposable Filters (0.2µm) | Thermo Scientific | 595-4520 | Langendorff apparatus |
| Blood gas analyzers | Radiometer | ABL90 FLEX PLUS | Gas analyzer |
| 70% ethanol | VWR | UN1170 | Cleaning tubings |
| 100% ethanol | Merck | 64-17-5 | Cleaning tubings |
| Wistar Rats | Janvier | – | Animals |
| Stainless Scissors | AESCULAP | BC702R | Surgical Instruments |
| Stainless Scissors | AESCULAP | BC257R | Surgical Instruments |
| Big Forceps | AESCULAP | – | Surgical Instruments |
| 8m/m Stainless Forceps | F.S.T | 11052-10 | Surgical Instruments |
| superfine (10/0) emery paper | 3M | 051111-11694 | Reverse heart model |
References
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