Den inverterte hjertemodellen for interstitial transudatsamling fra det isolerte rottehjertet
Summary
Denne protokollen beskriver en metode for å samle hjerteinterstitusjonsvæske fra det isolerte, perfuserte rottehjertet. For å fysisk separere interstitial transudat fra koronar venøs utløpspreparat, er Langendorff perfusert hjerte invertert, og transsittet (interstitial fluid) dannet på hjerteoverflaten oppsamles ved bruk av en myk latexhett.
Abstract
Den foreliggende protokoll beskriver en unik tilnærming som muliggjør oppsamling av hjerte-transudat (CT) fra det isolerte, saltvann-perfuserte rottehjertet. Etter isolering og retrograd perfusjon av hjertet i henhold til Langendorff-teknikken, blir hjertet omvendt til en opp-ned-stilling og mekanisk stabilisert av et ballonkateter satt inn i venstre ventrikel. Deretter plasseres en tynn latexdeksel – tidligere kastet for å matche den gjennomsnittlige størrelsen på rottehjertet – over epikardialoverflaten. Utløpet av latexhetten er koblet til silisiumrør, med den distale åpningen 10 cm under hjørnets grunnnivå, noe som gir liten suging. CT kontinuerlig produsert på epikardialoverflaten oppsamles i iskjølte ampuller for videre analyse. Graden av CT-dannelse varierte fra 17 til 147 μl / min (n = 14) i kontroll- og infarcted hjerter, som representerer 0,1-1% av koronar venøs effluentperfusat. Proteomisk analyse og høy perfoRmance væskekromatografi (HPLC) viste at den oppsamlede CT inneholder et bredt spekter av proteiner og purinerge metabolitter.
Introduction
Hjertefeil (HF) er den viktigste dødsårsaken hos mennesker over hele verden 1 . HF forekommer ofte på grunn av myokarditt, iskemisk fornærmelse mot myokardiet og omvendt ventrikulær remodeling, noe som fører til en progressiv forverring av kardial kontraktil funksjon og pasientens livskvalitet. Selv om fremskritt i kardiologi og hjerteoperasjon har bemerkelsesverdig redusert HF-dødelighet, tjener de bare som forbigående "forsinkelser" av en uunngåelig progressiv sykdomsprosess som bærer signifikant sykelighet. Derfor understreker den nåværende mangelen på effektiv behandling behovet for å identifisere nye molekylære mål som kan forhindre eller til og med reversere HF. Dette inkluderer endringer i den ekstracellulære matrisen, ukontrollert hjerteimmunrespons og interaksjoner mellom hjerte- og ikke-hjerteceller 2 .
Det er viktig å gjenkjenne at mikromiljøet som hjerteceller er utsatt for direcTly former immunforsvaret og regenerativ respons av det skadede hjertet. I det isolerte, saltvannsprimerte hjerte genereres CT på hjerteoverflaten i form av små dråper som er avledet fra det interstitielle væskenommet ( dvs. mikromiljøet), både under fysiologiske og patofysiologiske forhold 3 , 4 , 5 . Derfor kan analyse av CT ( dvs. interstitial fluid) bidra til å identifisere faktorer som regulerer hjertemetabolisme og kontraktil funksjon 6 eller påvirke immuncellefunksjoner etter migrering i det skadede hjertet. Potensielt kan dette føre til utvikling av nye terapeutiske strategier for behandling av HF.
Samlingen av CT fra murine hjerter er teknisk utfordrende. I vanlige Langendorff-perfuserte hjerter er den eksklusive samlingen av CT vanskelig fordi blandingen av CT med coronarY venøs effluent perfusat fortynner uforutsigbart noen konsentrasjon av metabolitter / enzymer frigjort fra interstitial rom. En mulig strategi for å overvinne denne begrensningen er å utelukke venøsutløpet ved å kannulere pulmonal og samtidig ligere lungearten 7 . Denne metoden står imidlertid overfor vanskeligheter forbundet med kanyleringen og ligeringen av lungearterien og venen, og forårsaker potensiell lekkasje av venøst utløp i hjerte-transduatet. Konseptet med å bruke en omvendt hjertemodell ble først introdusert av gruppen Kammermeier, som omvendte det isolerte, perfuserte hjertet til en oppå-ned-stilling og satt en tynn latexhett på epikardialoverflaten for kontinuerlig å prøve CT uten forurensning av venøst utløp 8 , 9 . Ved hjelp av denne prosedyren ble CT vist å gi et svært følsomt mål for metabolittene frigjort fra hjertet 9 ,Kapillær overføring av fettsyrer 8 og virale partikler 10 .
Mer nylig har parakrine faktorer som kan regulere den lokale immunresponsen og øke hjerteangiogenese 11 blitt implisert i de gunstige effektene av stamcellebasert terapi for hjertesykdom. Analysen av CT i reversert hjerte kan bidra til å kjemisk identifisere disse individuelle parakrine faktorene. I tillegg kan CT bidra til å identifisere faktorene som er involvert i in vivo aktivering av immunceller i hjertet.
Den detaljerte beskrivelsen av CT-samling fra hjerteoverflaten, som er angitt her, er eksperimentelt nyttig for forskere som studerer samspillet mellom immunceller, fibroblaster, endotelceller og kardiomyocytter i forhold til total hjertefunksjon. Som nevnt ovenfor bærer interstitialvæsken informasjonen for celle-til-celle-kommunikasjon i hjertet, whDet kan enkelt vurderes ved innsamling av CT. Den detaljerte tekniske beskrivelsen, inkludert en videoprotokol for hvordan å samle CT fra reversert hjerte, skal lette den fremtidige anvendelsen av denne unike teknikken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den reverserte hjertemodellen er basert på den veletablerte Langendorff hjerte perfusjonsteknikken 12 og utføres ved ganske enkelt å vende hjertet inn i en opp og ned stilling og holde denne posisjonen ved hjelp av et stivt intra-ventrikulært ballonkateter. På en slik måte kan hjerteinterstitialtranssudat separeres fysisk fra koronar venøs effluentperfusat, dripping av tyngdekraften fra hjertet av hjertet 9 . CT kan samles kontinuerlig ved hjelp av en tynn og fleksi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne studien ble finansiert av NSFC 81570244, FoKo 23/2013, og SFB 1116 / B01 og av Kardiovaskulær Forskningsinstitut Düsseldorf (CARID).
Materials
| Latex Solution | ProChemie | Z-Latex LA-TZ | http://kautschukgesellschaft.de/%E2%80%A8z-latexla-tz%E2%80%A8 |
| Aluminum Mold | Home made | – | Reverse heart model |
| Universal Ovens | Memmert | UNB 400 | Reverse heart model |
| Latex Balloon | Hugo Sachs | Size 4 | Reverse heart model |
| Milling Machine | Proxxon | MF70 | Reverse heart model |
| Sodium Chloride | Sigma | SZBD0810V | Chemicals |
| Sodium Hydrogen Carbonate | Roth | 68852 | Chemicals |
| Potassium Chloride | Merck | 49361 | Chemicals |
| Magnesium Sulphate Heptahydrate | Merck | 58861 | Chemicals |
| Potassium Dihydrogen Phosphate | Merck | 48731 | Chemicals |
| D(+)-Glucose Anhydrous | Merck | 83371 | Chemicals |
| Calcium Chloride Dihydrate | Fluka | 21097 | Chemicals |
| Balance | VWR | SE 1202 | Weighing chemicals |
| Double Distilled Water | Millpore | – | Disolving chemicals |
| Medical Pressure Transducer | Gold | – | Langendorff apparatus |
| Medical Flow Probe | Transonic | 3PXN | Langendorff apparatus |
| Heating Circulating Bath | Haake | B3 ; DC1 | Langendorff apparatus |
| Laboratory and Vaccum Tubing | Tygon | R-3603 | Langendorff apparatus |
| Animal Research Flowmeters | Transonic | T206 | Langendorff apparatus |
| PowerLab Data Acquisition Device | AD Instruments | Chart 7.1 | Langendorff apparatus |
| LabChart Data Acquisition Software | AD Instruments | Chart 7.1 | Langendorff apparatus |
| Peristaltic Pump | Glison | MINIPULS 3 | Langendorff apparatus |
| Glass Water Column | home made | – | Langendorff apparatus |
| Water Bath Protective Agent | VWR | 462-7000 | Langendorff apparatus |
| Sterile Disposable Filters (0.2µm) | Thermo Scientific | 595-4520 | Langendorff apparatus |
| Blood gas analyzers | Radiometer | ABL90 FLEX PLUS | Gas analyzer |
| 70% ethanol | VWR | UN1170 | Cleaning tubings |
| 100% ethanol | Merck | 64-17-5 | Cleaning tubings |
| Wistar Rats | Janvier | – | Animals |
| Stainless Scissors | AESCULAP | BC702R | Surgical Instruments |
| Stainless Scissors | AESCULAP | BC257R | Surgical Instruments |
| Big Forceps | AESCULAP | – | Surgical Instruments |
| 8m/m Stainless Forceps | F.S.T | 11052-10 | Surgical Instruments |
| superfine (10/0) emery paper | 3M | 051111-11694 | Reverse heart model |
References
- Henkel, D. M., Redfield, M. M., Weston, S. A., Gerber, Y., Roger, V. L. Death in heart failure: a community perspective. Circ Heart Fail. 1 (2), 91-97 (2008).
- Limana, F., et al. Myocardial infarction induces embryonic reprogramming of epicardial c-kit(+) cells: role of the pericardial fluid. J Mol Cell Cardiol. 48 (4), 609-618 (2010).
- Brunner, F. Cardiac tissue endothelin-1 levels under basal, stimulated, and ischemic conditions. J Cardiovasc Pharmacol. 26, S44-S46 (1995).
- de Lannoy, L. M., et al. Renin-angiotensin system components in the interstitial fluid of the isolated perfused rat heart. Local production of angiotensin I. Hypertension. 29 (6), 1240-1251 (1997).
- Strupp, M., Kammermeier, H. Interstitial Lactate And Glucose-Concentrations Of the Isolated-Perfused Rat-Heart before, during And after Anoxia. Pflugers Arch. 423 (3-4), 232-237 (1993).
- Wienen, W., Jungling, E., Kammermeier, H. Enzyme-Release into the Interstitial Space of the Isolated Rat-Heart Induced by Changes in Contractile Performance. Cardiovasc Res. 28 (8), 1292-1298 (1994).
- De Deckere, E. A., Ten Hoor, ., P, A modified Langendorff technique for metabolic investigations. Pflugers Arch. 370 (1), 103-105 (1977).
- Tschubar, F., Rose, H., Kammermeier, H. Fatty acid transfer across the myocardial capillary wall. J Mol Cell Cardiol. 25 (4), 355-366 (1993).
- Wienen, W., Kammermeier, H. Intra- and extracellular markers in interstitial transudate of perfused rat hearts. Am J Physiol. 254 (4 Pt 2), H785-H794 (1988).
- Sasse, A., Ding, Z. P., Wallich, M., Godecke, A., Schrader, J. Vascular transfer of adenovirus is augmented by nitric oxide in the rat heart. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 287 (3), H1362-H1368 (2004).
- Gnecchi, M., Zhang, Z., Ni, A., Dzau, V. J. Paracrine mechanisms in adult stem cell signaling and therapy. Circ Res. 103 (11), 1204-1219 (2008).
- Herr, D. J., Aune, S. E., Menick, D. R. Induction and Assessment of Ischemia-reperfusion Injury in Langendorff-perfused Rat Hearts. J Vis Exp. (101), e52908 (2015).
- Ding, Z., et al. Epicardium-Derived Cells Formed After Myocardial Injury Display Phagocytic Activity Permitting In Vivo Labeling and Tracking. Stem Cells Transl Med. 5 (5), 639-650 (2016).
- Hartwig, S., et al. Secretome profiling of primary human skeletal muscle cells. Biochim Biophys Acta. 1844 (5), 1011-1017 (2014).
- Smolenski, R. T., Lachno, D. R., Ledingham, S. J. M., Yacoub, M. H. Determination of sixteen nucleotides, nucleosides and bases using high-performance liquid chromatography and its application to the study of purine metabolism in hearts for transplantation. J Chromatogr. 527 (2), 414-420 (1990).
- Decking, U. K., Juengling, E., Kammermeier, H. Interstitial transudate concentration of adenosine and inosine in rat and guinea pig hearts. Am J Physiol. 254 (6 Pt 2), H1125-H1132 (1988).
- Heller, L. J., Mohrman, D. E. Estimates of interstitial adenosine from surface exudates of isolated rat hearts. J Mol Cell Cardiol. 20 (6), 509-523 (1988).
