Spinal Cord Neurons Isolatie en Cultuur van Neonatale Muizen
Summary
Deze studie presenteert een techniek voor de isolatie van neuronen van WT-neonatale muizen. Het vereist de zorgvuldige dissectie van het ruggenmerg van de neonatale muis, gevolgd door de scheiding van neuronen uit het ruggenmergweefsel door mechanische en enzymatische splitsing.
Abstract
Wij presenteren een protocol voor de isolatie en de cultuur van de ruggengraat neuronen. De neuronen worden verkregen uit neonatale C57BL / 6 muizen en zijn geïsoleerd op postnatale dag 1-3. Een muis rommel, meestal 4-10 pups geboren uit een fokpaar, is verzameld voor een experiment, en wervelkoorden worden individueel van elke muis verzameld na euthanasie met isofluraan. De wervelkolom wordt uitgescheiden en vervolgens wordt het ruggenmerg uit de kolom vrijgegeven. De ruggenmergen worden vervolgens gehakt om het oppervlaktegebied van een enzymatische protease te verhogen waardoor de neuronen en andere cellen uit het weefsel vrijkomen. Trituratie wordt dan gebruikt om de cellen in oplossing te laten lossen. Deze oplossing wordt vervolgens gefractioneerd in een dichtheidsgradiënt om de verschillende cellen in oplossing te scheiden, waardoor neuronen geïsoleerd worden. Ongeveer 1-2,5 x 10 6 neuronen kunnen geïsoleerd worden uit één nestgroep. De neuronen worden dan geplant op putjes die met lijm facto zijn bedektRs die zorgen voor een goede groei en rijping. De neuronen duurt ongeveer 7 dagen om volwassenheid te bereiken in het groei- en kweekmedium en kan daarna worden gebruikt voor behandeling en analyse.
Introduction
Het begrijpen van ruggengraatpatologie vereist het gebruik van verschillende modellen, zowel op macroscopische als microscopische niveaus. Grote en kleine dierenmodellen 1 , 2 , 3 worden gebruikt voor in vivo onderzoeken naar ruggengraatziekte en letsel. Terwijl het bestuderen van deze problemen in vivo zijn voordelen heeft, is de analyse van het ruggenmerg beperkt tot het gehele ruggenmerghomogenaat of aan weefselafdelingen 4 . Dit zorgt voor een beetje dubbelzinnigheid bij het proberen om specifieke reacties en doelen in het ruggenmerg tussen zijn inwendige neuronen en omliggende glia te isoleren. De toenemende beschikbaarheid van genetisch gemanipuleerde muizen zorgt voor meer gedetailleerde onderzoeken van de biologie op cellulaire en moleculaire niveaus. Zo wordt hier een neonataal muismodel gebruikt, waarmee in vitro de unieke eigenschappen en biologie van ruggengraatneuronen kunnen worden onderzocht.
Ent "> Het isoleren en onderhouden van neuronen in vitro is niet bijzonder eenvoudig. Er is een relatief groot aantal technieken voor neuronisolatie van het corticale weefsel van volwassen knaagdieren die lijken te leiden tot een aanzienlijk aantal geïsoleerde neuronen (dat wil zeggen miljoenen) 5 , 6 , 7. In tegenstelling is de opbrengst van neuronen van het ruggenmergweefsel lager 8 , 9 , 10 , mede door de kleinere massa weefsel. Verder is er bij muizen een relatief lage mate van technieken voor de isolatie van neonatale Ruggenmergneuronen, en bestaande methoden worden beperkt door lagere neuronopbrengsten ( dwz honderden) 9 of moeizame en resourcezware technieken die de isolatie van embryonale muizen vereisen 10 .In dit protocol, wijGebruik een techniek die het mogelijk maakt om een kostbare en resource-effectieve isolatie van een aanzienlijk aantal neuronen uit de ruggenmergen van neonatale muizen mogelijk te maken. Zoals gebruikelijk bij eerder gepubliceerde technieken, gebruiken we papain als enzymatisch protease, waardoor neuronen uit het ruggengraatweefsel 5 , 6 vrijkomen. Daarnaast gebruiken we een dichtheidsgradiënt voor verfijnde celscheidingen, die eerder bleek effectief te zijn 6 , 10 . Terwijl het medium waarin de cellen geïncubeerd zijn, kunnen verschillen, in onze ervaring en zoals eerder gepubliceerd 11 , is de aanvulling met vers B27-kweekmedium supplement essentieel voor de lange levensduur van de neuron. De neuronen zijn meestal levensvatbaar voor maximaal 10 dagen, waardoor de behandeling kan worden uitgevoerd.
Protocol
Representative Results
Discussion
Deze techniek zorgt voor de betrouwbare cultuur van de ruggengraat neuronen. Zodra de vaardigheid in de techniek is bereikt, duurt het ongeveer 3,5 uur om te voltooien. We hebben in ongeveer 4 uur de isolatie van neuronen uit 2 afzonderlijke nestjes (16 muizen totaal) kunnen uitvoeren. De belangrijkste stap in haalbaarheid is om de ruggengraatjes van de muizen op een goede manier te kunnen extraheren. De opbrengst zorgt voor het platen van meerdere putjes en voor het vermogen om de neuronen onder verschillende omstandig…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
De auteurs hebben geen erkenningen.
Materials
| Hibernate A Medium – 500 mL | Thermo-Fisher | A1247501 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501 |
| Hibernate A Minus Calcium – 500 mL | Brainbits | HA-Ca | http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/ |
| Glutamax 100X – 100 mL | Thermo-Fisher | 35050061 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079 |
| B27 Supplement 50X – 10 mL | Thermo-Fisher | 17504044 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044 |
| Papain, Lyophilized – 100 mg | Worthington | LS003119 | http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html |
| Neurobasal A Medium – 500 mL | Thermo-Fisher | 10888022 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Poly-D-lysine hydrobromide – 5 mg | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en®ion=US |
| Mouse Laminin – 1 mg | Thermo-Fisher | 23017015 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015 |
| Trypan Blue – 20 mL | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en®ion=US |
| OptiPrep Density Gradient Medium – 250 mL | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en®ion=US |
| Dichlorodimethylsilane (DMDCS, Sigma Silicoat) | Sigma-Aldrich | 440272-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en®ion=US |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306-1L | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion=US |
| Glass Pippette – 9" | Sigma-Aldrich | 13-678-20C | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en®ion=US |
| Pipette bulb – 5 mL | Sigma-Aldrich | Z186678-3EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en®ion=US&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1 |
| BRAND® Petri dish, glass – 60×15 mm | Sigma-Aldrich | BR455717-10EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en®ion=US |
| Sterile 24 Well Cell Culture Plate | Sigma-Aldrich | M8812-100EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en®ion=US |
| Hausser Hemacytometer (glass counting chamber) | Fischer Scientific | 02-671-6 | https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716 |
| Glass Slides – 12 mm sterile cover glass – uncoated | Neuvitro | GG-12-1.5-Pre | http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm |
| NeuN Rabbit Monoclonal Antibody – 100 µL | Abcam | ab177487 | After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluded to 1:200 for 18 hours in 4 °C |
| MAP-2 Mouse Monoclonal Antibody – 50 µL | Abcam | ab11267 | After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluded to 1:500 for 18 hours in 4 °C |
References
- Qayumi, A. K., et al. Animal model for investigation of spinal cord injury caused by aortic cross-clamping. J Invest Surg. 10 (1-2), 47-52 (1997).
- Fang, B., et al. Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption. Int J Mol Sci. 14 (5), 10343-10354 (2013).
- Taira, Y., Marsala, M. Effect of proximal arterial perfusion pressure on function, spinal cord blood flow, and histopathologic changes after increasing intervals of aortic occlusion in the rat. Stroke. 27 (10), 1850-1858 (1996).
- Stoppini, L., Buchs, P. -. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Ahlemeyer, B., Baumgart-Vogt, E. Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0. 5) C57Bl/6J mice. J Neurosci Methods. 149 (2), 110-120 (2005).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nat Protoc. 2 (6), 1490-1498 (2007).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126 (3), 397-425 (1977).
- Graber, D. J., Harris, B. T. Purification and culture of spinal motor neurons from rat embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (4), 319-326 (2013).
- Anderson, K. N., Potter, A. C., Piccenna, L. G., Quah, A. K., Davies, K. E., Cheema, S. S. Isolation and culture of motor neurons from the newborn mouse spinal cord. Brain Res Prot. 12 (3), 132-136 (2004).
- Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 163 (1), 111-118 (2007).
- Brewer, G. J., et al. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
- Fang, B., et al. Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption. Int J Mol Sci. 14 (5), 10343-10354 (2013).
- Su, M., Zhong, W., Ren, S. Dose-dependent protection of reseveratrol against spinal cord ischemic-reperfusion injury in rats. Trop J Pharm Res. 15 (6), 1225-1233 (2016).
- Haapanen, H., et al. Remote ischemic preconditioning protects the spinal cord against ischemic insult: An experimental study in a porcine model. J Thorac Cardiovasc Surg. 151 (3), 777-785 (2016).
- Conrad, M. F., Ye, J. Y., Chung, T. K., Davison, J. K., Cambria, R. P. Spinal cord complications after thoracic aortic surgery: long-term survival and functional status varies with deficit severity. J Vasc Surg. 48 (1), 47-53 (2008).
- Wong, D. R., et al. Delayed spinal cord deficits after thoracoabdominal aortic aneurysm repair. Ann Thorac Surg. 83 (4), 1345-1355 (2007).
- Freeman, K. A., et al. Alpha-2 agonist attenuates ischemic injury in spinal cord neurons. J Surg Res. 195 (1), 21-28 (2015).
- Freeman, K. A., et al. Spinal cord protection via alpha-2 agonist-mediated increase in glial cell-line-derived neurotrophic factor. J Thorac Cardiovasc Surg. 149 (2), 578-586 (2015).
