Spinal Cord Neurons Isolasjon og kultur fra neonatale mus
Summary
Denne studien presenterer en teknikk for isolering av nevroner fra WT-neonatale mus. Det krever forsiktig disseksjon av ryggmargen fra nyfødtmusen, etterfulgt av separasjon av nevroner fra ryggmargsvevet gjennom mekanisk og enzymatisk spaltning.
Abstract
Vi presenterer en protokoll for isolasjon og kultur av ryggmargenneuroner. Nevronene er oppnådd fra neonatal C57BL / 6-mus og er isolert på postnatal dag 1-3. Et musekull, vanligvis 4-10 pupper født fra ett avlspar, samles for ett forsøk, og spinalkabler samles individuelt fra hver mus etter eutanasi med isofluran. Ryggsøylen blir dissekert og deretter frigjøres ryggmargen fra kolonnen. Spinalkablene blir deretter hakket for å øke leveringsflaten for en enzymatisk protease som tillater at nevronene og andre celler frigjøres fra vevet. Triturering brukes da til å frigjøre cellene i oppløsning. Denne oppløsningen fraksjoneres deretter i en tetthetgradient for å separere de forskjellige cellene i oppløsning, slik at nevroner kan isoleres. Omtrent 1-2,5 x 10 6 nevroner kan isoleres fra en kullgruppe. Nevronene blir så seedet på brønner belagt med klebende factoR som tillater riktig vekst og modning. Nevronene tar omtrent 7 dager for å oppnå modenhet i vekst- og kulturmediet og kan deretter brukes til behandling og analyse.
Introduction
Forståelse av ryggmargspatologi krever bruk av ulike modeller, både på makroskopiske og mikroskopiske nivåer. Store og små dyremodeller 1 , 2 , 3 brukes til in vivo undersøkelser av ryggmargs sykdom og skade. Mens studiene av disse problemene in vivo har sine fordeler, er ryggradsanalyse begrenset til hele ryggmargenhomogenatet eller til vevseksjoner 4 . Dette skaper noe tvetydighet når man prøver å isolere spesifikke svar og mål i ryggmargen blant sine hjemmehørende neuroner og omkringliggende glia. Den økende tilgjengeligheten av genetisk manipulerte mus muliggjør mer detaljerte undersøkelser av biologien ved cellulære og molekylære nivåer. Dermed brukes en neonatal musemodell her, noe som gjør det mulig å studere de unike egenskapene og biologien til ryggmargenerne in vitro .
Ent "> Isolering og vedlikehold av nevroner in vitro er ikke spesielt grei. Det er en relativ overflod av teknikker for nevronisolasjon fra det kortikale vev hos voksne gnagere som synes å resultere i et betydelig antall isolerte nevroner ( dvs. millioner) 5 , 6 , 7. I motsetning til dette er utbyttet av nevroner fra ryggmargsvev lavere 8 , 9 , 10 , delvis på grunn av den mindre massen av vev. Videre er det hos mus en relativ sparsomhet av teknikker for isolering av neonatal Ryggmargsneuroner, og eksisterende metoder er begrenset av lavere neuronutbytter ( dvs. hundrevis) 9 eller arbeidsomme og ressurskrevende teknikker som krever isolering av embryonale mus 10 .I denne protokollen, viBruk en teknikk som muliggjør kostnadseffektiv og isolerende isolasjon av et betydelig antall nevroner fra ryggraden til neonatalmus. Som det er vanlig i tidligere publiserte teknikker, bruker vi papain som en enzymatisk protease, som tillater frigivelse av nevroner fra ryggmargsvev 5 , 6 . I tillegg bruker vi en tetthetgradient for raffinert celleseparasjon, som tidligere har vist seg å være effektiv 6 , 10 . Selv om mediet hvor cellene er inkubert, kan det variere, i vår erfaring og som tidligere publisert 11 , at tilskudd med fersk B27-dyrkningsmedium supplement har vist seg å være kritisk for nevronlevetiden. Nevronene er vanligvis levedyktige i opptil 10 dager, slik at behandling kan utføres.
Protocol
Representative Results
Discussion
Denne teknikken tillater pålitelig kultur av ryggmargsneuroner. Når ferdighetene i teknikken er oppnådd, tar det ca. 3,5 timer å fullføre. Vi har vært i stand til å utføre isolasjonen av nevroner fra 2 separate kuller (16 mus totalt) på ca 4 timer. Nøkkeltrinnet i gjennomførbarhet er å være i stand til å utdanne spinalkordene effektivt fra musene. Utbyttet tillater plating flere brønner og for evnen til å teste nevronene under forskjellige forhold. Vi har vært i stand til å behandle nevronene etter mod…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne har ingen bekreftelser.
Materials
| Hibernate A Medium – 500 mL | Thermo-Fisher | A1247501 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A1247501 |
| Hibernate A Minus Calcium – 500 mL | Brainbits | HA-Ca | http://www.brainbitsllc.com/hibernate-a-minus-calcium/ |
| Glutamax 100X – 100 mL | Thermo-Fisher | 35050061 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/35050079 |
| B27 Supplement 50X – 10 mL | Thermo-Fisher | 17504044 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/17504044 |
| Papain, Lyophilized – 100 mg | Worthington | LS003119 | http://www.worthington-biochem.com/pap/cat.html |
| Neurobasal A Medium – 500 mL | Thermo-Fisher | 10888022 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10888022 |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Thermo-Fisher | 15140122 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15140122 |
| Poly-D-lysine hydrobromide – 5 mg | Sigma-Aldrich | P6407-5MG | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p6407?lang=en®ion=US |
| Mouse Laminin – 1 mg | Thermo-Fisher | 23017015 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/23017015 |
| Trypan Blue – 20 mL | Sigma-Aldrich | T8154-20ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t8154?lang=en®ion=US |
| OptiPrep Density Gradient Medium – 250 mL | Sigma-Aldrich | D1556-250ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d1556?lang=en®ion=US |
| Dichlorodimethylsilane (DMDCS, Sigma Silicoat) | Sigma-Aldrich | 440272-100ML | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/440272?lang=en®ion=US |
| Chloroform | Sigma-Aldrich | 288306-1L | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sial/288306?lang=en®ion=US |
| Glass Pippette – 9" | Sigma-Aldrich | 13-678-20C | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls7095d9?lang=en®ion=US |
| Pipette bulb – 5 mL | Sigma-Aldrich | Z186678-3EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/z186678?lang=en®ion=US&cm_sp=Insite-_-prodRecCold_xviews-_-prodRecCold10-1 |
| BRAND® Petri dish, glass – 60×15 mm | Sigma-Aldrich | BR455717-10EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/aldrich/br455717?lang=en®ion=US |
| Sterile 24 Well Cell Culture Plate | Sigma-Aldrich | M8812-100EA | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m8812?lang=en®ion=US |
| Hausser Hemacytometer (glass counting chamber) | Fischer Scientific | 02-671-6 | https://www.fishersci.com/shop/products/hausser-bright-line-phase-hemacytometer-hemacytometer/026716 |
| Glass Slides – 12 mm sterile cover glass – uncoated | Neuvitro | GG-12-1.5-Pre | http://www.neuvitro.com/german-coverslip-12mm-diameter.htm |
| NeuN Rabbit Monoclonal Antibody – 100 µL | Abcam | ab177487 | After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluded to 1:200 for 18 hours in 4 °C |
| MAP-2 Mouse Monoclonal Antibody – 50 µL | Abcam | ab11267 | After fixing in paraformaldehyde and blocking with 5% BSA, cells on a 12 mm coverslip were incubated in the antibody diluded to 1:500 for 18 hours in 4 °C |
References
- Qayumi, A. K., et al. Animal model for investigation of spinal cord injury caused by aortic cross-clamping. J Invest Surg. 10 (1-2), 47-52 (1997).
- Fang, B., et al. Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption. Int J Mol Sci. 14 (5), 10343-10354 (2013).
- Taira, Y., Marsala, M. Effect of proximal arterial perfusion pressure on function, spinal cord blood flow, and histopathologic changes after increasing intervals of aortic occlusion in the rat. Stroke. 27 (10), 1850-1858 (1996).
- Stoppini, L., Buchs, P. -. A., Muller, D. A simple method for organotypic cultures of nervous tissue. J Neurosci Methods. 37 (2), 173-182 (1991).
- Ahlemeyer, B., Baumgart-Vogt, E. Optimized protocols for the simultaneous preparation of primary neuronal cultures of the neocortex, hippocampus and cerebellum from individual newborn (P0. 5) C57Bl/6J mice. J Neurosci Methods. 149 (2), 110-120 (2005).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R. Isolation and culture of adult neurons and neurospheres. Nat Protoc. 2 (6), 1490-1498 (2007).
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126 (3), 397-425 (1977).
- Graber, D. J., Harris, B. T. Purification and culture of spinal motor neurons from rat embryos. Cold Spring Harb Protoc. 2013 (4), 319-326 (2013).
- Anderson, K. N., Potter, A. C., Piccenna, L. G., Quah, A. K., Davies, K. E., Cheema, S. S. Isolation and culture of motor neurons from the newborn mouse spinal cord. Brain Res Prot. 12 (3), 132-136 (2004).
- Gingras, M., Gagnon, V., Minotti, S., Durham, H. D., Berthod, F. Optimized protocols for isolation of primary motor neurons, astrocytes and microglia from embryonic mouse spinal cord. J Neurosci Methods. 163 (1), 111-118 (2007).
- Brewer, G. J., et al. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35 (5), 567-576 (1993).
- Fang, B., et al. Ischemic preconditioning protects against spinal cord ischemia-reperfusion injury in rabbits by attenuating blood spinal cord barrier disruption. Int J Mol Sci. 14 (5), 10343-10354 (2013).
- Su, M., Zhong, W., Ren, S. Dose-dependent protection of reseveratrol against spinal cord ischemic-reperfusion injury in rats. Trop J Pharm Res. 15 (6), 1225-1233 (2016).
- Haapanen, H., et al. Remote ischemic preconditioning protects the spinal cord against ischemic insult: An experimental study in a porcine model. J Thorac Cardiovasc Surg. 151 (3), 777-785 (2016).
- Conrad, M. F., Ye, J. Y., Chung, T. K., Davison, J. K., Cambria, R. P. Spinal cord complications after thoracic aortic surgery: long-term survival and functional status varies with deficit severity. J Vasc Surg. 48 (1), 47-53 (2008).
- Wong, D. R., et al. Delayed spinal cord deficits after thoracoabdominal aortic aneurysm repair. Ann Thorac Surg. 83 (4), 1345-1355 (2007).
- Freeman, K. A., et al. Alpha-2 agonist attenuates ischemic injury in spinal cord neurons. J Surg Res. 195 (1), 21-28 (2015).
- Freeman, K. A., et al. Spinal cord protection via alpha-2 agonist-mediated increase in glial cell-line-derived neurotrophic factor. J Thorac Cardiovasc Surg. 149 (2), 578-586 (2015).
