समयबद्धता संगठनात्मक स्लाइस में प्रवासित न्यूरॉन्स के कन्फोकल इमेजिंग भ्रूण माउस मस्तिष्क का प्रयोग करना<em> यूटरो में</em> विद्युतचरण

Summary

यह प्रोटोकॉल त्रिविकूल रूप से पका हुआ कॉर्टिकल न्यूरॉन्स के प्रत्यक्ष अवलोकन के लिए निर्देश प्रदान करता है। Utero electroporation में, organotypic टुकड़ा संस्कृति, और समय चूक confocal इमेजिंग संयुक्त करने के लिए संयुक्त रूप से और गतिशील overexpression या पलायन न्यूरॉन्स में ब्याज की जीन के downregulation के प्रभावों का अध्ययन और विकास के दौरान उनके भेदभाव का विश्लेषण करने के लिए संयुक्त कर रहे हैं।

Abstract

Utero electroporation में माउस भ्रूण विकसित करने के मस्तिष्क प्रांतस्था में रेडियल प्रवास की प्रक्रिया का अध्ययन करने के लिए एक तेज़ और शक्तिशाली दृष्टिकोण है। इसने रेडियल प्रवासन के विभिन्न चरणों का वर्णन करने और इस प्रक्रिया को नियंत्रित करने वाले आणविक तंत्रों को चिह्नित करने में मदद की है। माइग्रेट करने वाले न्यूरॉन्स का प्रत्यक्ष और गतिशील रूप से विश्लेषण करने के लिए उन्हें समय के साथ पता होना चाहिए। यह प्रोटोकॉल एक वर्कफ़्लो का वर्णन करता है जो कि अंगोटेपिक स्लाइस संस्कृति और समय-समाप्ति confocal इमेजिंग के साथ utero electroporation में जोड़ती है , जो सीधे परीक्षा और कॉर्डिकल न्यूरॉन्स को आंशिक रूप से पलायन के गतिशील विश्लेषण की अनुमति देता है। इसके अलावा, माइग्रेशनिंग न्यूरॉन्स, जैसे कि माइग्रेशन स्पीड, स्पीड प्रोफाइल, रेडियल ओरिएंटेशन परिवर्तन के विस्तृत लक्षण वर्णन संभव है। विधि आसानी से क्षतिग्रस्त होकर कार्य के लाभ के रूप में अच्छी तरह से बचाव प्रयोगों द्वारा कॉर्टिकल न्यूरॉन्स को आंशिक रूप से माइग्रेट करने में रुचि के जीनों के कार्यात्मक विश्लेषण करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है। समय समाप्तमाइग्रेट करने वाले न्यूरॉन्स की इमेजिंग एक अत्याधुनिक तकनीक है जो एक बार स्थापित की गई है जो न्यूरॉनल माइग्रेशन विकारों के माउस मॉडल में मस्तिष्क प्रांतस्था के विकास का अध्ययन करने के लिए एक शक्तिशाली उपकरण है।

Introduction

नेकोटेक्स संज्ञानात्मक, भावनात्मक और संवेदी कार्यों के प्रमुख स्थल है। यह मस्तिष्क की सतह के समानांतर में उन्मुख छह क्षैतिज परतों से बना है। पृष्ठीय टेलिन्फोलोन की पार्श्व की दीवार के विकास वाले पूर्व कोशिकाओं के दौरान प्रक्षेपण न्यूरॉन्स को जन्म देते हैं जो त्रिआयामी सतह को पियाल की ओर स्थानांतरित करते हैं और परत प्रकार-विशिष्ट न्यूरोनल पहचान प्राप्त करते हैं। वेन्ट्रिकुलर / सब्विन्टिकुलर जोन (वीजेड / एसवीजेड) में उत्पन्न होने के बाद ये न्यूरॉन्स ट्रांज़िर्योर मल्टीपोलर हो जाते हैं और उनके प्रवास को धीमा करते हैं। इंटरमीडिएट ज़ोन (आईजेड) में थोड़ी देर रहने के बाद वे एक द्विध्रुवी आकारिकी पर स्विच करते हैं, रेडियल ग्लिल स्कैफोल्ड से संलग्न होते हैं और कॉर्टिकल प्लेट (सीपी) में रेडियल ओरिएंटेड माइग्रेशन जारी करते हैं। अपने अंतिम लक्ष्य प्रक्षेपण न्यूरॉन्स तक पहुंचने पर रेडियल ग्लियाल प्रक्रियाओं से अलग होकर और परत-विशिष्ट पहचान हासिल कर लेते हैं। न्यूरॉनल प्रवासन के विभिन्न चरणों को प्रभावित करने वाले जीन में उत्परिवर्तन, गंभीर कॉर्टिकल कुरूपता, जैसे कि लिसेनकएफ़ीली या सफ़ेद मामला उत्थान ^{1 , 2}

Utero electroporation में कृंतक भ्रूण ^{3 , 4} के विकासशील मस्तिष्क में तंत्रिका पूर्वज कोशिकाओं को संक्रमित करने के लिए एक तेज़ और शक्तिशाली तकनीक है। इस तकनीक के साथ, न्यूरॉन्स के विकास में अपने कार्यों का अध्ययन करने के लिए यह पछाड़ना और / या ब्याज की अत्यधिक विषैले जीनों के लिए संभव है। इस विधि ने रूपात्मक विवरणों का वर्णन करने और रेडियल प्रवासन ^{5 , 6 , 7 , 8 , 9} की प्रक्रिया के आणविक तंत्रों को विशेष रूप से वर्णन करने में मदद की है। रेडियल माइग्रेटिंग न्यूरॉन्स सेल आकृति, माइग्रेशन स्पीड, साथ ही प्रवासी दिशा में गतिशील परिवर्तन से गुजरती हैं, जो समय के साथ प्रत्यक्ष और निरंतर अवलोकन की आवश्यकता होती है। ऑर्गोटाइपिक स्लाइस कंटूElectroporated दिमाग के फिर से और समय चूक confocal इमेजिंग समय के साथ सीधे नज़र रखने माइग्रेट करने की अनुमति देता है। इस संयुक्त दृष्टिकोण का उपयोग करना, माइग्रेट करने वाले न्यूरॉन्स की अलग-अलग विशेषताओं का विश्लेषण करना संभव है, जो कि electroporated दिमाग के निश्चित ऊतक वर्गों में जांच नहीं की जा सकती।

हमने हाल ही में electroporated दिमाग की टुकड़ा संस्कृतियों में न्यूरॉन्स पलायन cortical विकास ¹⁰ के दौरान प्रतिलेखन कारक बी सेल CLL / लिंफोमा 11A (Bcl11a) की भूमिका का अध्ययन करने के लिए आवेदन किया की समय-अंतराल कोंफोकल इमेजिंग। बीसीएलएलएए युवा प्रवासी काउर्टेलिक न्यूरॉन्स में व्यक्त किया गया है और हमने इसके कार्यों का अध्ययन करने के लिए एक सशर्त उत्परिवर्ती बीसीएलएलएएएएलएलएए ( बीसीएलएलएए ^{फ्लॉक्स} ) ¹¹ का इस्तेमाल किया है। बीसीएलएलएए ^{फ्लक्स / फ्लॉक्स} दिमाग के कॉर्टिकल प्राइजनीटर्स में हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी) के साथ क्रै ^{रिंकंबेनेस के इलेक्ट्रोप्रोरेज} ने हमें एक मोज़ेक उत्परिवर्ती स्थिति बनाने की अनुमति दी, जिसमें केवल कुछ कोशिकाओं में उत्परिवर्तित किया जाता हैअन्यथा जंगली प्रकार की पृष्ठभूमि इस तरह, एकल सेल स्तर पर बीसीएलएलएए के सेल-स्वायत्त कार्यों का अध्ययन करना संभव था। हमने पाया है कि Bcl11a उत्परिवर्ती न्यूरॉन्स उनके प्रवास ¹⁰ के दौरान कम गति, उनकी गति प्रोफाइल में बदलाव के साथ-साथ यादृच्छिक की तरह उन्मुखीकरण परिवर्तन प्रदर्शित करते हैं। उल्लिखित प्रोटोकॉल में हम सफल इलेक्ट्रोफ़ोरेशन और स्लाइस कल्चर की तैयारी के लिए वर्कफ़्लो का वर्णन करते हैं, ¹² माउस दिमाग के साथ-साथ कॉर्टिकल स्लाइस संस्कृतियों के समय-अंतराल confocal इमेजिंग।

Protocol

सभी प्रायोगिक प्रक्रियाएं पशु कल्याण समिति (रेगेरींग्सप्रिसीडिम ट्यूबिन्गेन) द्वारा अनुमोदित थीं और जर्मन पशु कल्याण अधिनियम और यूरोपीय संघ के निर्देशक 2010/63 / यूरोपीय संघ के अनुसार किए गए थे। <p class="jove_t…

Representative Results

इससे पहले, हमने दिखाया है कि गर्भाशय इलेक्ट्रोपोरॉज द्वारा बीसीएलएलएए के आनुवांशिक विलोपन ने देर से जन्म के ऊपरी-परत प्रोजेक्शन न्यूरॉन्स 10 के रेडियल प्रवास को बिगाड़…

Discussion

रेडियल माइग्रेशन नेकोटेक्स्ट विकास में एक महत्वपूर्ण प्रक्रिया है। इस प्रक्रिया के विभिन्न चरणों को प्रभावित करने वाले जीन में उत्परिवर्तन, लिसेंसफैली और सफ़ेद पदार्थों के उत्थान ^{1 ,} <sup …

Materials

isoflurane	Abbott Laboratories	506949	Forene
6-well plate	Corning	351146
12-well plate	Corning	351143
non-absorbable surgical suture	Ethicon	K890H	3/8 circle, 13 mm, taper point
Micro Adson Forceps	Fine Science Tools	11018-12	serrated, length: 12 cm
fine scissors	Fine Science Tools	14063-09	angled to side, length: 9 cm
Mathieu Needle Holder	Fine Science Tools	12510-14	tungsten carbide, length: 14 cm
fine tipped forceps	Fine Science Tools	11370-40	straight, 11 cm
Vannas Tübingen Spring Scissors	Fine Science Tools	15005-08	angled up, 9.5 cm
ring forceps	Fine Science Tools	11103-09	OD: 3mm, ID, 2.2 mm, length: 9 cm
HBSS (10X)	Gibco	14180046
L-Glutamine	Gibco	25030081
Penicillin/Streptomycin	Gibco	15140122
horse serum	Gibco	26050088
BME	Gibco	41010026
borosilicate glass capillaries	Harvard Apparatus	30-0016	1.0 OD x 0.58 ID x 100 L mm
anesthsesia system	Harvard Apparaus	72-6471
anesthetizing chamber	Harvard Apparaus	34-0460
fluosorber filter canister	Harvard Apparaus	34-0415
low melting point agarose	Invitrogen	16520100
vibrating blade microtome	Leica	VT1200 S
fluorescence stereo microscope	Leica	M205 FA
stereo microscope	Leica	M125
inverted fluorescence tissue culture microscope	Leica	DM IL LED
confocal laser scanning microscope	Leica	TCS SP5II
hybrid detector	Leica	HyD
objective, 40x/0.60 NA	Leica	11506201
microscope temperature control system	Life Imaging Services	Cube, Brick & Box
cell culture insert	Millipore	PICM0RG50
microgrinder	Narishige	EG-45	use 38° angle for beveling
microinjector	Parker Hannifin	052-0500-900	Picospritzer III
carprofen	Pfizer Animal Health	NDC 61106-8507	Rimadyl
emdedding mold	Polysciences	18986-1
endotoxin-free plasmid maxi kit	Qiagen	12362
fast green	Sigma	F7252
laminin	Sigma	L2020
poly-L-lysine	Sigma	P5899
HEPES	Sigma	H4034
D-glucose	Sigma	G6152
calcium chloride	Sigma	C7902
magensium sulfate	Sigma	M2643
sodium bicarbonate	Sigma	S6297
square wave electroporator	Sonidel	CUY21EDIT
tweezers with 5 mm platinum disk electrodes	Sonidel	CUY650P5
micropipette puller	Sutter Instrument	P-97
box filament	Sutter Instrument	FB255B	2.5 mm x 2.5 mm
micro-spoon spatula	VWR	231-0191	185 mm x 5 mm
glass bottom dish, 50 mm	World Precision Instruments	FD5040-100