זמן לשגות Confocal הדמיה של נוירונים נודדים תרבות פרוסה Organotypic של המוח עכבר עובריים באמצעות<em> באוטרו</em> Electroporation
Summary
פרוטוקול זה מספק הוראות תצפית ישירה של נוירונים קליפת המוח נודדת. ב electroporation ברחם , תרבות פרוסות organotypic, הדמיה confocal זמן לשגות משולבים ישירות באופן דינמי ללמוד את ההשפעות של overexpression או downregulation של גנים של עניין נודדים נודדות ולנתח את ההבחנה שלהם במהלך הפיתוח.
Abstract
ב electroporation ברחם היא גישה מהירה ורבת עוצמה ללמוד את תהליך ההגירה רדיאלי בקליפת המוח של פיתוח עוברי העכבר. זה עזר לתאר את השלבים השונים של הגירה רדיאלי ולאפיין את המנגנונים המולקולריים השולטים בתהליך זה. כדי לנתח באופן דינמי באופן דינמי נוירונים נודדים הם צריכים להיות עקבות לאורך זמן. פרוטוקול זה מתאר זרימת עבודה המשלבת electroporation ברחם עם תרבות פרוסות organotypic זמן הדמיה confocal confocal, המאפשר בדיקה ישירה וניתוח דינמי של נוירונים קליפתיים נודדים. יתר על כן, אפיון מפורט של נוירונים נודדים, כגון מהירות הגירה, פרופילים מהירות, כמו גם שינויים אוריינטציה רדיאלי, אפשרי. השיטה יכולה בקלות להיות מותאמת לבצע ניתוחים פונקציונליים של גנים של עניין נוירונים קליפת המוח נודדים רדיאלי ידי הפסד ורווח של פונקציה, כמו גם ניסויים הצלה. זמן לשגותהדמיה של נוירונים נודדים היא טכניקה המדינה- of-the-art שפעם הוקמה הוא כלי רב עוצמה כדי לחקור את הפיתוח של קליפת המוח במודלים העכבר של הפרעות הגירה עצביים.
Introduction
הניאוקורטקס הוא האתר המרכזי של תפקודים קוגניטיביים, רגשיים וסנסוריים-מוטוריים. הוא מורכב משש שכבות אופקיות המכוונות במקביל אל פני השטח של המוח. במהלך התפתחות תאים אב בקיר לרוחב של telencephalon הגבי לעורר נוירונים הקרנה כי נודדים באופן רדיאלי לעבר פני השטח pial ולרכוש שכבת סוג ספציפי נוירונים זהות. לאחר שנוצר באזורים חד חדרית / subventricular (VZ / SVZ) נוירונים אלה הופכים רב קוטביים transiently ו להאט את ההגירה שלהם. לאחר שהייה קצרה באזור הביניים (IZ) הם עוברים למורפולוגיה דו קוטבית, נצמדים לגרדום הגליה הרדיאלי, וממשיכים בהגירה מכוונת רדיאלית לצלחת הקליפתית (CP). כאשר מגיעים היעד הסופי שלהם נוירונים הקרנה לנתק מן התהליכים גליה רדיאלי לרכוש זהות ספציפית שכבת. מוטציות בגנים המשפיעות על שלבים שונים של הגירה נוירונים יכולים לגרום למום קליפת המוח חמורה, כגון lissencEphaly או חומר לבן heterotopia 1 , 2 .
ב electroporation ברחם היא טכניקה מהירה וחזקה transfect תאים עצביים עצביים במוח המתפתח של עוברי מכרסם 3 , 4 . בעזרת טכניקה זו ניתן מציאה ו / או overexpress גנים של עניין על מנת ללמוד את הפונקציות שלהם בפיתוח נוירונים. שיטה זו סייעה במיוחד לתאר את הפרטים המורפולוגיים ולאפיין את המנגנונים המולקולריים של תהליך ההגירה הרדיאלית 5 , 6 , 7 , 8 , 9 . נוירונים נודדים באופן קיצוני עוברים שינויים דינאמיים בצורת התא, מהירות ההגירה, וכן כיוון הנדידה, הדורשים תצפית ישירה ורציפה לאורך זמן. אורגנוטיפ פרוסה cultuמחדש זמן לשגות confocal הדמיה של המוח electroporated לאפשר לצפות ישירות נוירונים נודדים לאורך זמן. באמצעות גישה זו בשילוב, ניתן לנתח תכונות שונות של נוירונים נודדים כי לא ניתן לחקור בקטעי רקמה קבועה של המוח electroporated.
לאחרונה החלת הדמיה confocal זמן לשגות של נוירונים נודדים בתרבויות פרוסה של המוח electroporated ללמוד את התפקיד של גורם שעתוק B תא CLL / לימפומה 11a (Bcl11a) במהלך פיתוח קליפת המוח 10 . Bcl11a מתבטאת נוירונים בקליפת המוח נודדים צעירים והשתמשנו אלל Bcl11a מוטציה מותנה ( Bcl11a flox ) 11 ללמוד את תפקידיו. Electroporation של recombinase Cre יחד עם חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) לתוך אבות קליפת המוח של המוח Bcl11a flox / flox מותר לנו ליצור מצב מוטציה פסיפס, שבו רק תאים מעטים הם מוטציה באחרת wild-type רקע. בדרך זו, ניתן היה ללמוד תאים אוטונומיים פונקציות של Bcl11a ברמת התא בודד. מצאנו כי Bcl11a נוירונים מוטציה להציג מהירות מופחתת, שינויים פרופילים מהירות שלהם, כמו גם שינויים בכיוון אקראי במהלך המעבר שלהם 10 . בפרוטוקול המתואר אנו מתארים זרימת עבודה עבור electroporation מוצלח פרוסה הכנה תרבות 12 של המוח עכבר, כמו גם זמן לשגות הדמיה confocal של תרבויות פרוסה קליפת המוח.
Protocol
Representative Results
Discussion
הגירה רדיאלית היא תהליך מפתח בפיתוח הניאוקורטקס. מוטציות בגנים המשפיעים על שלבים שונים של תהליך זה יכולים לגרום מומים קשים בקליפת המוח, כולל lissencephaly ו heterotopia חומר לבן 1 , 2 . לאחרונה הראינו כי Bcl11a, אשר באה לידי ביטוי צעירים נודד נוירונים ק…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
אנו מודים לז 'אקלין Andratschke, אלנה Werle, Sachi Takenaka, ו Matthias Tober עבור סיוע טכני מעולה, כמו גם ויקטור Tarabykin לדיונים מועילים. עבודה זו נתמכה על ידי מענק של דויטשה Forschungsgemeinschaft כדי SB (BR-2215).
Materials
| isoflurane | Abbott Laboratories | 506949 | Forene |
| 6-well plate | Corning | 351146 | |
| 12-well plate | Corning | 351143 | |
| non-absorbable surgical suture | Ethicon | K890H | 3/8 circle, 13 mm, taper point |
| Micro Adson Forceps | Fine Science Tools | 11018-12 | serrated, length: 12 cm |
| fine scissors | Fine Science Tools | 14063-09 | angled to side, length: 9 cm |
| Mathieu Needle Holder | Fine Science Tools | 12510-14 | tungsten carbide, length: 14 cm |
| fine tipped forceps | Fine Science Tools | 11370-40 | straight, 11 cm |
| Vannas Tübingen Spring Scissors | Fine Science Tools | 15005-08 | angled up, 9.5 cm |
| ring forceps | Fine Science Tools | 11103-09 | OD: 3mm, ID, 2.2 mm, length: 9 cm |
| HBSS (10X) | Gibco | 14180046 | |
| L-Glutamine | Gibco | 25030081 | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140122 | |
| horse serum | Gibco | 26050088 | |
| BME | Gibco | 41010026 | |
| borosilicate glass capillaries | Harvard Apparatus | 30-0016 | 1.0 OD x 0.58 ID x 100 L mm |
| anesthsesia system | Harvard Apparaus | 72-6471 | |
| anesthetizing chamber | Harvard Apparaus | 34-0460 | |
| fluosorber filter canister | Harvard Apparaus | 34-0415 | |
| low melting point agarose | Invitrogen | 16520100 | |
| vibrating blade microtome | Leica | VT1200 S | |
| fluorescence stereo microscope | Leica | M205 FA | |
| stereo microscope | Leica | M125 | |
| inverted fluorescence tissue culture microscope | Leica | DM IL LED | |
| confocal laser scanning microscope | Leica | TCS SP5II | |
| hybrid detector | Leica | HyD | |
| objective, 40x/0.60 NA | Leica | 11506201 | |
| microscope temperature control system | Life Imaging Services | Cube, Brick & Box | |
| cell culture insert | Millipore | PICM0RG50 | |
| microgrinder | Narishige | EG-45 | use 38° angle for beveling |
| microinjector | Parker Hannifin | 052-0500-900 | Picospritzer III |
| carprofen | Pfizer Animal Health | NDC 61106-8507 | Rimadyl |
| emdedding mold | Polysciences | 18986-1 | |
| endotoxin-free plasmid maxi kit | Qiagen | 12362 | |
| fast green | Sigma | F7252 | |
| laminin | Sigma | L2020 | |
| poly-L-lysine | Sigma | P5899 | |
| HEPES | Sigma | H4034 | |
| D-glucose | Sigma | G6152 | |
| calcium chloride | Sigma | C7902 | |
| magensium sulfate | Sigma | M2643 | |
| sodium bicarbonate | Sigma | S6297 | |
| square wave electroporator | Sonidel | CUY21EDIT | |
| tweezers with 5 mm platinum disk electrodes | Sonidel | CUY650P5 | |
| micropipette puller | Sutter Instrument | P-97 | |
| box filament | Sutter Instrument | FB255B | 2.5 mm x 2.5 mm |
| micro-spoon spatula | VWR | 231-0191 | 185 mm x 5 mm |
| glass bottom dish, 50 mm | World Precision Instruments | FD5040-100 |
References
- Evsyukova, I., Plestant, C., Anton, E. S. Integrative mechanisms of oriented neuronal migration in the developing brain. Annu Rev Cell Dev Biol. 29, 299-353 (2013).
- Kwan, K. Y., Sestan, N., Anton, E. S. Transcriptional co-regulation of neuronal migration and laminar identity in the neocortex. Development. 139 (9), 1535-1546 (2012).
- Saito, T., Nakatsuji, N. Efficient gene transfer into the embryonic mouse brain using in vivo electroporation. Dev Biol. 240 (1), 237-246 (2001).
- Tabata, H., Nakajima, K. Efficient in utero gene transfer system to the developing mouse brain using electroporation: visualization of neuronal migration in the developing cortex. Neuroscience. 103 (4), 865-872 (2001).
- LoTurco, J. J., Bai, J. The multipolar stage and disruptions in neuronal migration. Trends Neurosci. 29 (7), 407-413 (2006).
- Noctor, S. C., Martinez-Cerdeno, V., Ivic, L., Kriegstein, A. R. Cortical neurons arise in symmetric and asymmetric division zones and migrate through specific phases. Nat Neurosci. 7 (2), 136-144 (2004).
- Tabata, H., Nakajima, K. Multipolar migration: the third mode of radial neuronal migration in the developing cerebral cortex. J Neurosci. 23 (31), 9996-10001 (2003).
- Pacary, E., et al. Proneural transcription factors regulate different steps of cortical neuron migration through Rnd-mediated inhibition of RhoA signaling. Neuron. 69 (6), 1069-1084 (2011).
- Tabata, H., Nagata, K. Decoding the molecular mechanisms of neuronal migration using in utero electroporation. Medical Molecular Morphology. 49 (2), 63-75 (2016).
- Wiegreffe, C., et al. Bcl11a (Ctip1) Controls Migration of Cortical Projection Neurons through Regulation of Sema3c. Neuron. 87 (2), 311-325 (2015).
- John, A., et al. Bcl11a is required for neuronal morphogenesis and sensory circuit formation in dorsal spinal cord development. Development. 139 (10), 1831-1841 (2012).
- Polleux, F., Ghosh, A. The slice overlay assay: a versatile tool to study the influence of extracellular signals on neuronal development. Sci STKE. (136), pl9 (2002).
- Greig, L. C., Woodworth, M. B., Galazo, M. J., Padmanabhan, H., Macklis, J. D. Molecular logic of neocortical projection neuron specification, development and diversity. Nat Rev Neurosci. 14 (11), 755-769 (2013).
- De Marco Garcia, N. V., Fishell, G. Subtype-selective electroporation of cortical interneurons. J Vis Exp. (90), e51518 (2014).
- Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration. J Vis Exp. (85), (2014).
- Venkataramanappa, S., Simon, R., Britsch, S. Ex utero electroporation and organotypic slice culture of mouse hippocampal tissue. J Vis Exp. (97), (2015).
- Simon, R., et al. A dual function of Bcl11b/Ctip2 in hippocampal neurogenesis. EMBO J. 31 (13), 2922-2936 (2012).
- Youn, Y. H., Pramparo, T., Hirotsune, S., Wynshaw-Boris, A. Distinct dose-dependent cortical neuronal migration and neurite extension defects in Lis1 and Ndel1 mutant mice. J Neurosci. 29 (49), 15520-15530 (2009).
- Nadarajah, B., Brunstrom, J. E., Grutzendler, J., Wong, R. O., Pearlman, A. L. Two modes of radial migration in early development of the cerebral cortex. Nat Neurosci. 4 (2), 143-150 (2001).
- Higginbotham, H., Yokota, Y., Anton, E. S. Strategies for analyzing neuronal progenitor development and neuronal migration in the developing cerebral cortex. Cereb Cortex. 21 (7), 1465-1474 (2011).
- Stubbs, D., et al. Neurovascular congruence during cerebral cortical development. Cereb Cortex. 19, i32-i41 (2009).
- Ayala, R., Shu, T., Tsai, L. H. Trekking across the brain: the journey of neuronal migration. Cell. 128 (1), 29-43 (2007).
- Humpel, C. Organotypic brain slice cultures: A review. Neuroscience. 305, 86-98 (2015).
