Estudios de Virus de influenza A en un modelo murino de infección
Summary
Virus de la gripe A (gripe) son importantes patógenos respiratorios humanos. Para entender la patogenicidad de gripe y realizar ensayos preclínicos de vacunas nuevos enfoques, modelos animales, imitar la fisiología humana se requieren. Aquí, describimos las técnicas para evaluar el IAV patogenia, respuesta humoral y eficacia de la vacuna utilizando un modelo murino de infección.
Abstract
Virus de la influenza causan más de 500.000 muertes en todo el mundo1 y se asocian con un costo anual de US $ 12 billones en los Estados Unidos solo considerando médica directa y gastos de hospitalización y ausentismo de trabajo2. Modelos animales son cruciales en los estudios de Influenza A virus (IAV) evaluar patogenesia viral, interacciones huésped-patógeno, respuesta inmune, y la eficacia de la vacuna actual o nuevos enfoques así como antivirales. Los ratones son un modelo animal pequeño ventajoso porque su sistema inmunológico es evolutivamente similar a ése encontrado en los seres humanos, están disponibles de proveedores comerciales como sujetos genéticamente idénticos, existen múltiples cepas que pueden ser aprovechadas para evaluar la base genética de las infecciones, y son relativamente baratas y fáciles de manipular. Para recapitular la infección IAV en los seres humanos a través de las vías respiratorias, ratones primero son anestesiados antes de la inoculación intranasal con gripe infecciosa bajo contención de bioseguridad adecuado. Después de la infección, la patogenesia de la gripe se determina mediante el control diario de la morbilidad (pérdida de peso corporal) y la tasa de mortalidad (supervivencia). Además, patogenesia viral también puede evaluarse mediante la evaluación de replicación del virus en la parte superior (mucosa nasal) o tracto respiratorio (pulmones) inferior de ratones infectados. Las respuestas humorales sobre infección de IAV pueden rápidamente evaluar sangrado no invasiva y la detección del anticuerpo secundario ensayos destinados a detectar la presencia de total o anticuerpos neutralizantes. Aquí, describimos los métodos comunes utilizados para infectar ratones intranasal (i.n) con IAV y evaluar patogénesis, respuesta inmune humoral y eficacia de protección.
Introduction
Gripe es virus envueltos, clasificados en la familia de Orthomyxoviridae 3. Contienen ocho moléculas de ARN monocatenario con polaridad negativa3. En los seres humanos, gripe causa epidemias estacionales y pandemias ocasionales de consecuencia importante cuando se introducen nuevos virus en la población humana4. Por otra parte, gripe estacional es altamente y rápidamente transmitida entre los seres humanos produciendo una elevada pérdida económica en todo el mundo cada año2,5. IAV los síntomas incluyen tos, congestión nasal, fiebre, malestar general, cefalea, anorexia y mialgias, pero el virus también puede producir una enfermedad más severa en pacientes inmunocomprometidos6. De hecho, la Organización Mundial de la salud (OMS) calcula que el virus de la gripe estacional causan 300.000-500.000 muertes en todo el mundo cada año1. Hay sólo dos clases de medicamentos actualmente aprobados por la Food and Drug Administration (FDA) para la profilaxis de la gripe y tratamiento en seres humanos: inhibidores de la neuraminidasa (NA) (p. ej., oseltamivir) y bloqueadores del canal iónico M2 (p. ej., amantadina); sin embargo, la aparición de variantes del virus resistentes a los medicamentos es una preocupación cada vez mayor. Vacunación, por lo tanto, sigue siendo la mejor opción médica para proteger a los seres humanos contra las infecciones de gripe. Hasta la fecha, tres tipos de influenza hay vacunas aprobadas por la FDA para el uso humano: las vacunas de proteínas recombinantes virales hemagglutinin (HA), inactivadas vacunas contra la influenza (IIV) y viva atenuada de influenza vacunas (LAIV)5, 7. las tres vacunas están diseñadas para inducir la respuesta inmune adaptativa contra la proteína viral de la HA, el objetivo principal de neutralizar anticuerpos contra la gripe.
Un modelo de ratón validado para el estudio de infección de IAV en vivo
Se han utilizado modelos animales para estudiar, entre otros, IAV patogenesia8,9,10,11, factores virales que contribuyen a la enfermedad12 o transmisión viral13 ,14, y probar la eficacia de nuevas vacunas o antivirales fármacos9,10,15. Ratones (Mus musculus) son el modelo animal más ampliamente utilizado para la investigación IAV por varias razones: 1) el sistema inmune es evolutivamente similar al que presentan en los seres humanos; compra animal de bajo costo, incluyendo 2), la vivienda y la reproducción; 3) pequeño tamaño fácilmente manipular y almacenar; 4) variabilidad de host mínimo para obtener respuestas homogéneas y resultados; 5) un gran conocimiento de la biología de ratones, incluyendo la secuencia del genoma; 6) muchos disponible biología molecular y/o reactivos de Inmunología; 7) disponible knock out (KO) de ratones para estudiar la contribución de una proteína huésped dado en infección viral; y, 8) múltiples cepas de ratón que pueden ser aprovechadas para evaluar las bases genéticas de las infecciones.
Hay varias cepas de ratón disponibles actualmente para el estudio de IAV en vivo. Edad, estado inmunitario, sexo, cepa genética de fondo y el ratón, así como rutas de infección, dosis y cepas del virus de influyen en el resultado de la infección del IAV en ratones. Las cepas de ratón más comunes utilizadas en la investigación IAV son C57BL/6, BALB/C y, más recientemente, DBA.2 ratones ya que son más susceptibles a la enfermedad IAV que dos cepas anteriores16,17,18, 19 , 20. lo que es importante, la respuesta inmune también puede ser diferente dependiendo de la cepa de ratón18,19,20. Por lo tanto, es muy importante recuperar toda la información disponible sobre el ratón y la cepa IAV a elegir la mejor opción para el experimento a realizarse.
Aunque el ratón es un buen modelo animal de infección para los estudios en vivo IAV, tienen varias limitaciones, que deben considerarse en el diseño experimental. Por ejemplo, una limitación importante de la utilización de ratones en vivo estudios es que la gripe no transmite entre ratones. Así, para la transmisión de los estudios, más aceptado modelos animales (e.g., hurones o cobayas) son usados16,17,21. Además, hay varias diferencias entre las manifestaciones del IAV en ratones y seres humanos. A diferencia de los seres humanos, ratones no desarrollan fiebre con infección de IAV; por el contrario presentan hipotermia16,17. En ratones, replicación de IAV se concentra en el tracto respiratorio inferior (pulmones) en lugar de las vías aéreas superiores. Por lo tanto, virulencia del IAV en ratones no se correlaciona siempre al que se observa en los seres humanos. En conjunto, ya que las ventajas compensan las desventajas limitadas, ratón representa el primer modelo animal para evaluar patogenesia viral gripe, inmunogenicidad y eficacia protectora en los estudios de vacunas y antivirales. Por otra parte, no sería éticamente aceptable para llevar a cabo estudios con IAV usando modelos animales grandes sin pruebas previas en un pequeño modelo animal de infección IAV. En este manuscrito, describimos cómo infectar ratones intranasal (i.n.) con IAV, cómo controlar la severidad y progreso de la infección viral y cómo llevar a cabo los experimentos necesarios para evaluar la respuesta inmune humoral y la eficacia de protección.
Protocol
Representative Results
Discussion
El modelo de ratón de IAV es ampliamente utilizado en vivo estudios de eficacia IAV patogenesia, inmunogenicidad y protección. El pequeño tamaño de los ratones los hace fáciles de manipular y almacenar en comparación con otros modelos animales tales como hurones o cobayas. Además, la facilidad en términos de costo de animal, alojamiento y reproducción permiten su uso en pruebas de vacunación pre clínicos en los que se necesitan grandes cantidades de animales. En particular, ya que los ratones se han u…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Investigación sobre el virus de la gripe en laboratorio LM-S es financiada parcialmente por la Nueva York Influenza centro de excelencia (NYICE), miembro de la NIAID centros de excelencia para la investigación de la Influenza y vigilancia (CEIRS). Agradecemos a Wendy Bates por su apoyo en las correcciones del manuscrito.
Materials
| Madin-Darby Canine Kidney (MDCK) epithelial cells | ATCC | CCL-34 | |
| Six- to eight-week-old female C57BL/6 mice | National Cancer Institute (NCI) | 01XBE | |
| Turckey red blod cells | Biolink Inc | Store at 4°C | |
| Dulbecco’s modified Eagle’s medium (DMEM) | Corning Cellgro | 15-013-CV | Store at 4°C |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Seradigm | 1500-050 | Store at -20°C |
| Penicillin/Streptomycin/L-Glutamine (PSG) 100X | Corning | 30-009-CI | Store at -20°C |
| Penicillin/Streptomycin (PS) 100X | Corning | 30-00-CI | Store at -20°C |
| Bovin Albumin solution (BA) | Sigma-Aldrich | A7409 | Store at 4°C |
| Bovin Serum Albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9647 | Store at 4°C |
| Tosylsulfonyl phenylalanyl chloromethyl ketone (TPCK)-treated trypsin | Sigma-Aldrich | T8802 | Store at -20°C |
| Neutral Buffered Formalin 10% | EMD | 65346-85 | Store at RT |
| Triton X-100 | J.T.Baker | X198-07 | Store at RT |
| Monoclonal Antibody anti-NP Influenza A Virus HB-65 | ATTC | H16-L10-4R5 | Store at -20°C |
| Polyclonal rabbit anti-mouse immunoglobulins/FITC | Dako | F0261 | Store at 4°C |
| ECL Anti-mouse IgG, Horseradish Peroxidase linked whole antibody | GE Healthcare | LNA931V/AG | Store at 4°C |
| TMB substrate set | BioLegend | 421101 | Store at 4°C |
| Vmax Kinetic plate reader | Molecular Devices | ||
| Dounce Tissue Grinders | Thomas Scientific | 7722-7 | |
| Receptor destroying enzyme, RDE (II) | Denka Seiken Co. | 370013 | Store at -20°C |
| Crystal Violet | Fisher Scienctific | C581-100 | Store at RT |
| 96-well Cell Culture Plate | Greiner Bio-one | 655-180 | |
| Cell Culture dishes 100mm | Greiner Bio-one | 664-160 | |
| Nunc MicroWell 96-Well Microplates | Thermo Fisher Scienctific | 269620 | |
| Nunc 96-Well Polystyrene Conical Bottom MicroWell Plates | Thermo Fisher Scienctific | 249570 | |
| Puralub Vet Ointment | Dechra | 9N-76855 | |
| Fluorescent microscope | Olympus | Olympus IX81 |
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