मानव माइॉब्लास्ट्स अलगाव, मायाजक विभेदन का आकलन और स्टोर-संचालित कैल्शियम एंट्री मापन
Summary
यहां, हम वयस्क मांसपेशियों के ऊतकों से मानव म्यॉब्लास्ट की शुद्ध जनसंख्या प्राप्त करने के लिए एक पद्धति का वर्णन करते हैं। इन कोशिकाओं का उपयोग इन विट्रो कंकाल की मांसपेशी विभेद में अध्ययन करने के लिए किया जाता है, और विशेषकर, सीए 2+ सिग्नलिंग में शामिल प्रोटीन का अध्ययन करने के लिए।
Abstract
उपग्रह कोशिकाएं (एससी) मांसपेशी तंतुओं के प्लाज्मा झिल्ली के बीच स्थित मांसपेशी स्टेम कोशिकाओं और आसपास के बेसल लैमिना हैं। वे मांसपेशियों के उत्थान के लिए आवश्यक हैं चोट पर, जो कंकाल की मांसपेशियों में अक्सर होता है, अनुसूचित जाति सक्रिय होते हैं। वे म्यॉब्लास्ट के रूप में फैल जाते हैं और मांसपेशियों के घावों की मरम्मत के लिए अंतर करते हैं। मांसपेशियों के भेदभाव के दौरान होने वाली कई घटनाओं में, साइटोसोलिक सीए 2 + सिग्नल बहुत महत्वपूर्ण हैं। इन सीए 2 + सिग्नल सीए 2+ से आंतरिक सीए -2+ स्टोर्स से रिलीज हो सकते हैं, साथ ही बाह्य अंतरिक्ष से सीए 2+ एंट्री से, विशेष रूप से दुकान संचालित सीए 2 + एंट्री (एसओसीई) से उठता है। यह पेपर अस्थि-चिकित्सा सर्जरी के बाद एकत्र हुए मांसपेशियों के नमूनों से मानव मैबोलास्ट की शुद्ध आबादी प्राप्त करने के लिए इस्तेमाल की जाने वाली एक पद्धति का वर्णन करता है। ऊतक यंत्रवत् और एंजाइमिक रूप से पच जाता है, और कोशिकाओं को विस्तारित किया जाता है और फिर विशिष्टता की उपस्थिति के अनुसार प्रवाह cytometry द्वारा क्रमबद्ध किया जाता हैफिक झिल्ली मार्कर एक बार प्राप्त होने पर, संस्कृति के माध्यम से विकास के कारकों को हटाकर मानव म्यॉब्लास्ट का विस्तार किया जाता है और विभेद करने के लिए प्रतिबद्ध है। विशिष्ट प्रतिलेखन कारकों और इन विट्रो इम्युनोफ्लोरेसेंस के अभिव्यक्ति के स्तर का उपयोग नियंत्रण परिस्थितियों में मायोजेनिक भेदभाव प्रक्रिया का आकलन करने के लिए किया जाता है और सीए 2+ सिग्नलिंग में शामिल होने वाले प्रोलीन प्रोटीन के बाद किया जाता है। अंत में, हम फ्यूरा -2 के उपयोग को रातिओमेट्रिक सीए 2+ जांच के रूप में विस्तारित करते हैं जो SOCE के विश्वसनीय और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य माप प्रदान करता है।
Introduction
मानव कंक्रीट की मांसपेशियों में संक्रमित समूहों के समूह होते हैं, बहु-केन्द्रित मांसपेशियों के फाइबर्स जिसके परिणामस्वरूप मायोजेनिक पूर्ववर्ती कोशिकाओं के संलयन होते हैं। कंकाल की मांसपेशियों में अनुसूचित जाति की मौजूदगी के लिए चोट के बाद पुनर्जन्म होने की क्षमता है, कंफ़्टरल पेशी स्टेम कोशिकाएं जो मायोफिबर (सरकोलेमा) और बेसल लैमिना के प्लाज्मा झिल्ली के बीच स्थित होती हैं। निर्जीव मांसपेशी में, अनुसूचित जातियों ज्यादातर मौन राज्य में मौजूद हैं। यांत्रिक तनाव या चोट के जवाब में, अनुसूचित जातियों को सक्रिय (मायोब्लास्ट) बन जाते हैं, पैदा होते हैं, और एसआईसी पूल 1 , 2 को फिर से भरने के लिए नए मायोफिबर या आत्म-नवीकरण करने के लिए भेदभाव से गुजरती हैं। इन वर्षों में, अनुसूचित जातियों और उनकी संतान, म्यॉब्लास्ट को कंकाल की मांसपेशी बायोप्सी से अलग करने के लिए कई तकनीकों का विकास किया गया था। कोशिका की सतह के मार्करों की अधिक समझ के साथ इन कोशिकाओं और प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) 3 की पद्धति पर व्यक्त की गई, 4 , 5 , अब मांसपेशियों के नमूनों से मानव म्यॉब्लास्ट की शुद्ध आबादी को अलग करना संभव है।
कैल्शियम सिग्नलिंग कंकाल की मांसपेशियों के विकास, होमोस्टैसिस और पुनर्जनन को नियंत्रित करती है। विशेष रूप से, सीए 2 + एंट्री जो इंट्रासेल्युलर स्टोर कम करने के बाद सक्रिय होती है, जिसे एसओसीई कहा जाता है, इन प्रक्रियाओं के लिए बहुत महत्व 6 है। सेल उत्तेजना पर, एंडो / सर्पोप्लाज्मिक रेटिकुलम (ईआर / एसआर) में सीए 2 + स्तर कम हो जाता है, जो बदले में प्लाज्मा झिल्ली सीए 2 + चैनल सक्रिय करता है जो ईआर / एसआर 7 को फिर से भरने के लिए Ca 2+ एंट्री की अनुमति देता है। एसओसीई में शामिल दो मुख्य प्रोटीन ईआर / एसआर सीए 2+ हैं – स्ट्रॉमल इंटरैक्शन अणु 1 (एसटीआईएम 1) प्रोटीन और प्लाज्मा झिल्ली सीए 2 + चैनल ओराई 1। कंकाल की मांसपेशियों में इन दोनों प्रोटीन, साथ ही एक ही परिवार के अन्य प्रोटीन (एसटीआईएम 2 एएनडी ओराई 2-ओराई 3) 8 , 9 और कई सीए 2+ -अभिव्यक रिसेप्टर संभावित कैनोनिकल (टीआरपीसी) परिवार 10 , 11 , 12 , 13 के पारगम्य चैनल। एसओईई मार्ग के माध्यम से सीए 2+ एंट्री मांसपेशियों के गठन / उत्थान 14 के लिए बहुत महत्वपूर्ण है। एसटीआईएम 1 या ओराई 1 प्रोटीन का म्यूटेशन मांसपेशी समारोह पर हानिकारक प्रभाव है, मुख्य रूप से पेशी हाइपोटोनिया 15 के लिए अग्रणी है। एसओसीई हानि के साथ पशु मॉडल भी मांसपेशियों और बल को कम करते हैं, साथ में बढ़ी हुई थकावट 6 , 16 , 17 के साथ । जैसा कि उल्लेख किया गया है, अन्य एसटीआईएम और ओराई प्रोटीन, साथ ही साथ कई टीआरपीसी चैनल, कंकाल की मांसपेशी में व्यक्त हैं, और उनकी भूमिकाएं अब तक निर्धारित नहीं की गई हैं। घ दस्तक करकेअपनी अभिव्यक्ति के स्तर का मालिक है, इसलिए एसओसीई में उनके निहितार्थ की जांच करना संभव है और मानवीय कंकाल की मांसपेशियों के भेदभाव के दौरान उनकी भूमिकाएं हैं।
एसईसीई माप दो अलग-अलग दृष्टिकोणों का उपयोग कर किया जा सकता है: इलेक्ट्रोफिज़ियोलॉजिकल वर्तमान रिकॉर्डिंग और सीए 2+ मापन। इलेक्ट्रोफिजियोलॉजी निश्चित रूप से एक अधिक प्रत्यक्ष पद्धति है, क्योंकि यह ब्याज की वर्तमान और उसके संबंधित इलेक्ट्रोफिजियोलॉजिकल हस्ताक्षर को मापता है। हालांकि, मांसपेशियों की कोशिकाओं पर इस तकनीक को लागू करना बहुत मुश्किल है, मुख्य रूप से मांसपेशी कोशिकाओं के बड़े आकार और अंतर्जात SOCE वर्तमान के छोटे आकार के कारण। साइटोसोलिक सीए 2 + इमेजिंग तकनीकी रूप से बहुत पहुँचा जा सकता है, लेकिन उपाय, अधिक अप्रत्यक्ष है के रूप में सीए 2 + स्तर साइटोसोल में मापा दोनों सीए के प्रवेश 2 + और फिर से पम्पिंग सेल से बाहर या आंतरिक दुकानों में दर्शाता है।
एक कार्यप्रणाली जिसमें मायब्ल्लास्ट्स को मानव स्केले के छोटे टुकड़ों से अलग करना शामिल हैइस पत्र में एंजाइमिक पाचन, प्रवर्धन, और एफएसीएस के बाद एटियल मांसपेशियों को समझाया गया है। समय के साथ भेदभाव के मार्करों की अभिव्यक्ति का पालन करने के लिए मांसपेशियों के भेदभाव की प्रक्रिया और इम्यूनोफ्लोरेसेंस प्रोटोकॉल 18 को वर्णित किया गया है। अंत में, एसओईसी की माप और सीए 2+ सिग्नलिंग और कंकाल की मांसपेशी विभेद में अलग-अलग आयन चैनलों की भूमिका को समझाया गया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
वयस्क कंकाल की मांसपेशियों से मानव मैबोलास्ट्स का अलगाव और संस्कृति पेशी विभेद और मांसपेशियों के उत्थान के अध्ययन के लिए एक इन विट्रो मॉडल पेश करता है। इस पत्र में, हम एक प्रोटोकॉल प्र?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
यह काम स्विस नेशनल साइंस फाउंडेशन (अनुदान संख्या 310030-166313), "फोंडेशन सुइस डेल ला रिफेर्क ला लेस मेलैडीज मस्क्यूलायर्स", "फाउंडेशन मार्सेल लेविल्लंत" और "फोंडेशन डेल ला रिकरके ओस्टियो-आर्टिकुलायर" द्वारा किया गया था।
Materials
| Ham’s F10 | ThermoFisher Scientific | 31550-023 | |
| FCS | ThermoFisher Scientific | 10270-106 | Lot 41G5532K |
| BSA | Sigma | O5482 | |
| fetuin | Sigma | F3385 | |
| EGF | Corning | 354001 | |
| Dexamethansone | Sigma | D1756 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Creatine | Sigma | 27900 | |
| Pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | |
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Falcon 50 ml tube | Falcon | 352070 | |
| Falcon 15 ml tube | Falcon | 352096 | |
| Falcon 5 ml tube (FACS) | Falcon | 352058 | |
| Culture medium: OPTI-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985-047 | |
| Transfectant reagnt: RNAiMax | ThermoFisher Scientific | 1756064 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190-094 | |
| Mounting medium | Fluka | 10981 | |
| Mouse anti-MyHC * | DSHB | MF20 | concentrate |
| Mouse anti-myogenin | BD Pharmigen | 556358 | |
| Rabbit anti-MEF2 | Santa Cruz Biotech | C-21 | |
| Goat anti-mouse Alexa488 | ThermoFisher Scientific | A11029 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 546 | ThermoFisher Scientific | A11035 | |
| Mouse anti human CD56-Alexa488 | BD Pharmingen | 557699 | |
| Mouse anti human CD146-PECy7 | BD Pharmingen | 562135 | |
| Mouse anti human CD45-PE-CF594 | BD Pharmingen | 562279 | |
| Mouse anti human CD34-APC | BD Pharmingen | 345804 | |
| Mouse anti human CD144-PE | BD Pharmingen | 560410 | |
| Alexa Fluor 488 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557702 | |
| PECy7 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557872 | |
| PE-CF594 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 562292 | |
| APC mouse IgG1k | BD Pharmingen | 550854 | |
| PE mouse IgG1k | BD Pharmingen | 556650 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | CAUTION: toxic compound |
| Paraformaldehyde | Fluka | 762400 | |
| Fura-2 AM | ThermoFisher Scientific | F1201 | |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher Scientific | P3000MP | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | CAUTION : toxic compound |
| Ratio imaging acquisition software: Metafluor 6.3 | Molecular Device | ||
| * : MF 20 was deposited to the DSHB by Fischman, D.A. | |||
References
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