人成肌细胞的分离，造血分化的评估和存储操作的钙进入测量
Summary
在这里，我们描述了一种从成年肌肉组织中获得纯种人成肌细胞的方法。这些细胞用于研究体外骨骼肌分化，特别是研究参与Ca 2+信号传导的蛋白质。
Abstract
卫星细胞（SC）是位于肌纤维质膜与周围基底层之间的肌肉干细胞。它们对于肌肉再生至关重要。在骨骼肌经常发生的损伤中，SC被激活。它们作为成肌细胞增殖并分化以修复肌肉损伤。在肌肉分化过程中发生的许多事件中，胞质Ca 2+信号是非常重要的。这些Ca 2+信号来自内部Ca 2+储存物的Ca 2+释放，以及来自细胞外空间的Ca 2+进入，特别是存储操作的Ca 2+进入（SOCE）。本文介绍了一种用于从矫形外科手术后收集的肌肉样品中获得纯人类成肌细胞群体的方法。机械和酶消化组织，扩增细胞，然后根据特异性的存在通过流式细胞术分选fic膜标记。一旦获得，通过从培养基中除去生长因子，使人成肌细胞扩大并致力于分化。特异性转录因子和体外免疫荧光的表达水平用于评估控制条件下和沉默参与Ca 2+信号传导的蛋白质后的肌原性分化过程。最后，我们详细介绍了使用Fura-2作为比较的Ca 2+探针，提供可靠和可重复的SOCE测量。
Introduction
人骨骼肌由肌原纤维前体细胞融合产生的收缩性多核肌肉纤维组成。由于肌肉纤维（肌膜）和基底层之间的骨骼肌干细胞存在于骨骼肌干细胞之间，骨骼肌具有在损伤后再生的能力。在未受伤的肌肉中，SC主要存在于静止状态。响应于机械应力或损伤，雪旺成为激活（成肌细胞），增殖，和经历或者分化以形成新的肌纤维或自我更新来补充SC池1，2。多年来，开发了几种技术来分离SCs及其后代，成肌细胞，从骨骼肌活组织检查。对这些细胞上表达的细胞表面标志物的更多了解和荧光激活细胞分选（FACS）的方法3，4，5，现在有可能对人成肌细胞的纯群体从肌肉样品隔离。
钙信号调节骨骼肌发育，体内平衡和再生。尤其是钙条目是继细胞内储存消耗激活，叫SOCE，是这些过程很重要6。在细胞刺激后，内/肌质网（ER / SR）中的Ca 2+水平降低，这反过来激活允许Ca 2+进入以重新填充ER / SR 7的质膜Ca 2+通道。 SOCE中的两种主要蛋白质是ER / SR Ca 2+ –感染基质相互作用分子1（STIM1）蛋白和质膜Ca 2+通道Orai1。骨骼肌丰富地表达了这两种蛋白质，以及同一家族的其他蛋白质（STIM2 aND Orai2-Orai3）8,9和几个的Ca 2+瞬时受体电位规范（TRPC）家族10，11，12，13的可透过的通道。通过SOCE通路的Ca 2+进入对肌肉形成/再生十分重要14 。 STIM1或Orai1蛋白的突变对肌肉功能的有害影响，主要导致肌肉张力减退15。与SOCE障碍动物模型也具有增强的易疲劳6，16，17显示降低的肌肉质量和力量，在一起。如上所述，其他STIM和Orai蛋白以及许多TRPC通道在骨骼肌中表达，并且它们各自的作用迄今尚未确定。敲门拥有自己的表达水平，因此可以调查他们对SOCE及其在人类骨骼肌分化过程中的作用的影响。
可以使用两种不同的方法进行SOCE测量：电生理电流记录和Ca 2+测量。电生理学肯定是一种更直接的方法，因为它测量了目前的兴趣及其相关的电生理特征。然而，这种技术很难应用于肌肉细胞，主要是因为肌肉细胞的大尺寸和内源性SOCE电流的小尺寸。细胞溶质Ca 2+成像在技术上是非常易于使用的，但测量更为间接，因为细胞质中测量的Ca 2+水平反映了Ca 2+的进入和再次抽出细胞或内部商店。
一种方法，包括从肌肉的小块分离成肌细胞本文解释了酶消化，扩增和FACS后的等信号。肌肉分化和免疫荧光协议遵循分化标志物的表达随时间的过程中描述18。最后，解释了SOCE的测量和不同离子通道在Ca 2+信号和骨骼肌分化中的作用。
Protocol
Representative Results
Discussion
来自成年骨骼肌的人成肌细胞的分离和培养提供了体外模型来研究肌肉分化和肌肉再生。在本文中，我们提供了一种协议，允许以简单且成本有限的方式纯化高产量的人类成肌细胞。此外，该技术在分离的成肌细胞的百分比及其肌原性分化效率方面提供了可靠和可重现的结果。事实上，我们在细胞分选后获得约60％的人类成肌细胞。这些细胞可保持培养多达6代（约3…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
这项工作得到了瑞士国家科学基金会（拨款号310030-166313），“基金会马塞尔·莱瓦兰特基金会”以及“基金会报告”的支持。
Materials
| Ham’s F10 | ThermoFisher Scientific | 31550-023 | |
| FCS | ThermoFisher Scientific | 10270-106 | Lot 41G5532K |
| BSA | Sigma | O5482 | |
| fetuin | Sigma | F3385 | |
| EGF | Corning | 354001 | |
| Dexamethansone | Sigma | D1756 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Creatine | Sigma | 27900 | |
| Pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | |
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Falcon 50 ml tube | Falcon | 352070 | |
| Falcon 15 ml tube | Falcon | 352096 | |
| Falcon 5 ml tube (FACS) | Falcon | 352058 | |
| Culture medium: OPTI-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985-047 | |
| Transfectant reagnt: RNAiMax | ThermoFisher Scientific | 1756064 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190-094 | |
| Mounting medium | Fluka | 10981 | |
| Mouse anti-MyHC * | DSHB | MF20 | concentrate |
| Mouse anti-myogenin | BD Pharmigen | 556358 | |
| Rabbit anti-MEF2 | Santa Cruz Biotech | C-21 | |
| Goat anti-mouse Alexa488 | ThermoFisher Scientific | A11029 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 546 | ThermoFisher Scientific | A11035 | |
| Mouse anti human CD56-Alexa488 | BD Pharmingen | 557699 | |
| Mouse anti human CD146-PECy7 | BD Pharmingen | 562135 | |
| Mouse anti human CD45-PE-CF594 | BD Pharmingen | 562279 | |
| Mouse anti human CD34-APC | BD Pharmingen | 345804 | |
| Mouse anti human CD144-PE | BD Pharmingen | 560410 | |
| Alexa Fluor 488 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557702 | |
| PECy7 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557872 | |
| PE-CF594 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 562292 | |
| APC mouse IgG1k | BD Pharmingen | 550854 | |
| PE mouse IgG1k | BD Pharmingen | 556650 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | CAUTION: toxic compound |
| Paraformaldehyde | Fluka | 762400 | |
| Fura-2 AM | ThermoFisher Scientific | F1201 | |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher Scientific | P3000MP | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | CAUTION : toxic compound |
| Ratio imaging acquisition software: Metafluor 6.3 | Molecular Device | ||
| * : MF 20 was deposited to the DSHB by Fischman, D.A. | |||
References
- Dumont, N. A., Bentzinger, C. F., Sincennes, M. C., Rudnicki, M. A. Satellite Cells and Skeletal Muscle Regeneration. Compr Physiol. 5 (3), 1027-1059 (2015).
- Sambasivan, R., Tajbakhsh, S. Adult skeletal muscle stem cells. Results Probl Cell Differ. 56, 191-213 (2015).
- Chen, W. C., et al. Isolation of blood-vessel-derived multipotent precursors from human skeletal muscle. J Vis Exp. (90), e51195 (2014).
- Zheng, B., et al. Isolation of myogenic stem cells from cultures of cryopreserved human skeletal muscle. Cell Transplant. 21 (6), 1087-1093 (2012).
- Charville, G. W., et al. Ex Vivo Expansion and In Vivo Self-Renewal of Human Muscle Stem Cells. Stem Cell Reports. 5 (4), 621-632 (2015).
- Stiber, J., et al. STIM1 signalling controls store-operated calcium entry required for development and contractile function in skeletal muscle. Nat Cell Biol. 10 (6), 688-697 (2008).
- Prakriya, M., Lewis, R. S. Store-Operated Calcium Channels. Physiol Rev. 95 (4), 1383-1436 (2015).
- Darbellay, B., et al. STIM1- and Orai1-dependent store-operated calcium entry regulates human myoblast differentiation. J Biol Chem. 284 (8), 5370-5380 (2009).
- Darbellay, B., et al. Human muscle economy myoblast differentiation and excitation-contraction coupling use the same molecular partners, STIM1 and STIM2. J Biol Chem. 285 (29), 22437-22447 (2010).
- Nilius, B., Owsianik, G., Voets, T., Peters, J. A. Transient receptor potential cation channels in disease. Physiol Rev. 87 (1), 165-217 (2007).
- Vandebrouck, C., Martin, D., Colson-Van Schoor, M., Debaix, H., Gailly, P. Involvement of TRPC in the abnormal calcium influx observed in dystrophic (mdx) mouse skeletal muscle fibers. J Cell Bio. 158 (6), 1089-1096 (2002).
- Antigny, F., Koenig, S., Bernheim, L., Frieden, M. During post-natal human myogenesis, normal myotube size requires TRPC1- and TRPC4-mediated Ca(2)(+) entry. J Cell Sci. 126 (11), 2525-2533 (2013).
- Brinkmeier, H. TRP channels in skeletal muscle: gene expression, function and implications for disease. Adv Exp Med Biol. 704, 749-758 (2011).
- Pan, Z., Brotto, M., Ma, J. Store-operated Ca2+ entry in muscle physiology and diseases. BMB Rep. 47 (2), 69-79 (2014).
- Lacruz, R. S., Feske, S. Diseases caused by mutations in ORAI1 and STIM1. Ann N Y Acad Sci. 1356, 45-79 (2015).
- Li, T., et al. STIM1-Ca(2+) signaling is required for the hypertrophic growth of skeletal muscle in mice. Mol Cell Biol. 32 (15), 3009-3017 (2012).
- Wei-Lapierre, L., Carrell, E. M., Boncompagni, S., Protasi, F., Dirksen, R. T. Orai1-dependent calcium entry promotes skeletal muscle growth and limits fatigue. Nat Commun. 4, 2805 (2013).
- Konig, S., et al. Membrane hyperpolarization triggers myogenin and myocyte enhancer factor-2 expression during human myoblast differentiation. J Biol Chem. 279 (27), 28187-28196 (2004).
- Crisan, M., et al. A perivascular origin for mesenchymal stem cells in multiple human organs. Cell Stem Cell. 3 (3), 301-313 (2008).
- Bigot, A., et al. Age-Associated Methylation Suppresses SPRY1, Leading to a Failure of Re-quiescence and Loss of the Reserve Stem Cell Pool in Elderly Muscle. Cell Rep. 13 (6), 1172-1182 (2015).
- Bettadapur, A., et al. Prolonged Culture of Aligned Skeletal Myotubes on Micromolded Gelatin Hydrogels. Sci Rep. 6, 28855 (2016).
- Darbellay, B., Arnaudeau, S., Bader, C. R., Konig, S., Bernheim, L. STIM1L is a new actin-binding splice variant involved in fast repetitive Ca2+ release. J Cell Biol. 194 (2), 335-346 (2011).
- Sauc, S., et al. STIM1L traps and gates Orai1 channels without remodeling the cortical ER. J Cell Sci. 128 (8), 1568-1579 (2015).
- Demaurex, N. Calcium measurements in organelles with Ca2+-sensitive fluorescent proteins. Cell Calcium. 38 (3-4), 213-222 (2005).
