Aislamiento de los mioblastos humanos, evaluación de la diferenciación miogénica y medición de la entrada de calcio almacenada
Summary
Aquí, describimos una metodología para obtener una población pura de mioblastos humanos a partir de tejido muscular adulto. Estas células se utilizan para estudiar la diferenciación in vitro del músculo esquelético y, en particular, para estudiar las proteínas implicadas en la señalización del Ca 2+ .
Abstract
Las células satélites (SC) son células madre musculares localizadas entre la membrana plasmática de las fibras musculares y la lámina basal circundante. Son esenciales para la regeneración muscular. Tras la lesión, que se produce con frecuencia en los músculos esqueléticos, SCs se activan. Proliferan como mioblastos y se diferencian para reparar lesiones musculares. Entre los muchos eventos que tienen lugar durante la diferenciación muscular, citosólico Ca 2 + señales son de gran importancia. Estas señales de Ca 2+ surgen de la liberación de Ca2 + desde internas Ca 2 + tiendas, así como de entrada de Ca2 + desde el espacio extracelular, particularmente la entrada de Ca2 + store-operado (SOCE). Este artículo describe una metodología utilizada para obtener una población pura de mioblastos humanos a partir de muestras musculares recogidas después de la cirugía ortopédica. El tejido se digiere mecánica y enzimáticamente y las células se amplifican y luego se clasifican por citometría de flujo de acuerdo con la presencia deFic marcadores de membrana. Una vez obtenidos, los mioblastos humanos se expanden y se comprometen a diferenciarse eliminando factores de crecimiento del medio de cultivo. Los niveles de expresión de los factores de transcripción específicos y la inmunofluorescencia in vitro se utilizan para evaluar el proceso de diferenciación miogénica en condiciones de control y después de silenciar las proteínas implicadas en la señalización de Ca 2 + . Finalmente, detallamos el uso de Fura-2 como una sonda ratiométrica de Ca 2+ que proporciona mediciones confiables y reproducibles de SOCE.
Introduction
Los músculos esqueléticos humanos están compuestos de grupos de fibras musculares contráctiles, multinucleadas, resultantes de la fusión de células precursoras miogénicas. Los músculos esqueléticos tienen la capacidad de regenerarse después de la lesión gracias a la presencia de SC, las células madre del músculo esquelético situadas entre la membrana plasmática de las miofibras (sarcolemma) y la lámina basal. En el músculo no lesionado, los SC están presentes en su mayoría en estado de reposo. En respuesta al estrés mecánico oa la lesión, los SC se activan (mioblastos), proliferan y experimentan diferenciación para formar nuevas miofibras o auto-renovación para reponer el grupo SC 1 , 2 . A lo largo de los años, se desarrollaron varias técnicas para aislar los CS y su progenie, los mioblastos, de las biopsias del músculo esquelético. Con la mayor comprensión de los marcadores de superficie celular expresados en estas células y la metodología de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) 3, 4 , 5 , ahora es posible aislar poblaciones puras de mioblastos humanos a partir de muestras musculares.
La señalización del calcio regula el desarrollo del músculo esquelético, la homeostasis y la regeneración. En particular, la entrada de Ca2 + que se activa después del agotamiento de la tienda intracelular, llamada SOCE, es de gran importancia 6 para estos procesos. Tras la estimulación celular, disminuye el nivel de Ca 2 + en el retículo endo / sarcoplasmático (ER / SR), lo que a su vez activa los canales de Ca 2+ de la membrana plasmática que permiten la entrada de Ca 2+ para rellenar el ER / SR 7 . Las dos principales proteínas implicadas en SOCE son el ER / SR Ca 2 + -sensing stromal interacción molécula 1 (STIM1) de proteínas y la membrana plasmática Ca 2 + canal Orai1. El músculo esquelético expresa abundantemente estas dos proteínas, así como otras proteínas de las mismas familias (STIM2 aNd Orai2-Orai3) 8 , 9 y varios canales permeables al Ca2 + de la familia canónica de potencial transitorio del receptor (TRPC) 10 , 11 , 12 , 13 . Ca 2 + entrada a través de la vía SOCE es de gran importancia para la formación muscular / regeneración [ 14] . Mutaciones de STIM1 o Orai1 proteínas tienen efectos nocivos sobre la función muscular, lo que conduce principalmente a la hipotonía muscular [ 15] . Los modelos animales con deterioro de SOCE también muestran menor masa muscular y fuerza, junto con una mayor fatigabilidad 6 , 16 , 17 . Como se mencionó, otras proteínas STIM y Orai, así como muchos canales TRPC, se expresan en el músculo esquelético, y sus funciones respectivas no se han determinado hasta el momento. GolpeandoSu nivel de expresión, es posible investigar sus implicaciones en SOCE y sus funciones durante la diferenciación del músculo esquelético humano.
La medición de SOCE puede realizarse utilizando dos enfoques diferentes: registros de corriente electrofisiológica y mediciones de Ca 2+ . La electrofisiología es ciertamente un método más directo, ya que mide la corriente de interés y su firma electrofisiológica asociada. Sin embargo, esta técnica es muy difícil de aplicar a las células musculares, principalmente debido al gran tamaño de las células musculares y el pequeño tamaño de la corriente SOCE endógena. La obtención de imágenes de Ca 2+ citosólica es técnicamente muy accesible, pero la medida es más indirecta, ya que el nivel de Ca 2+ medido en el citosol refleja tanto la entrada de Ca 2+ como el re-bombeo fuera de la célula o en los almacenes internos.
Una metodología que incluye el aislamiento de mioblastos a partir de pequeñas piezas de skel humanoEtal después de digestión enzimática, amplificación y FACS se explica en este trabajo. Se describe el proceso de diferenciación muscular y el protocolo de inmunofluorescencia para seguir la expresión de marcadores de diferenciación con el tiempo 18 . Finalmente, se explican las medidas de SOCE y el papel de diferentes canales iónicos en la señalización de Ca 2+ y en la diferenciación del músculo esquelético.
Protocol
Representative Results
Discussion
El aislamiento y cultivo de mioblastos humanos a partir del músculo esquelético adulto ofrece un modelo in vitro para estudiar la diferenciación muscular y la regeneración muscular. En este artículo, proporcionamos un protocolo que permite la purificación de altos rendimientos de mioblastos humanos de una manera simple y costo-limitada. Además, esta técnica proporciona resultados fiables y reproducibles en términos de porcentaje de mioblastos aislados y su eficacia de d…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo contó con el apoyo de la Fundación Nacional Suiza para la Ciencia (subsidio número 310030-166313), la Fondation Suisse pour la recherche sur les maladies musculaires, la Fondation Marcel Levaillant y la Fondation pour la recherche ostéo-articulaire.
Materials
| Ham’s F10 | ThermoFisher Scientific | 31550-023 | |
| FCS | ThermoFisher Scientific | 10270-106 | Lot 41G5532K |
| BSA | Sigma | O5482 | |
| fetuin | Sigma | F3385 | |
| EGF | Corning | 354001 | |
| Dexamethansone | Sigma | D1756 | |
| Insulin | Sigma | I9278 | |
| Creatine | Sigma | 27900 | |
| Pyruvate | Sigma | P4562 | |
| Uridine | Sigma | U3003 | |
| Gentamycin | ThermoFisher Scientific | 15710-049 | |
| Trypsin-EDTA 0.05% | ThermoFisher Scientific | 25300-062 | |
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| 40 μm cell strainer | Falcon | 352340 | |
| Falcon 50 ml tube | Falcon | 352070 | |
| Falcon 15 ml tube | Falcon | 352096 | |
| Falcon 5 ml tube (FACS) | Falcon | 352058 | |
| Culture medium: OPTI-MEM | ThermoFisher Scientific | 31985-047 | |
| Transfectant reagnt: RNAiMax | ThermoFisher Scientific | 1756064 | |
| PBS | ThermoFisher Scientific | 14190-094 | |
| Mounting medium | Fluka | 10981 | |
| Mouse anti-MyHC * | DSHB | MF20 | concentrate |
| Mouse anti-myogenin | BD Pharmigen | 556358 | |
| Rabbit anti-MEF2 | Santa Cruz Biotech | C-21 | |
| Goat anti-mouse Alexa488 | ThermoFisher Scientific | A11029 | |
| Goat anti-rabbit Alexa 546 | ThermoFisher Scientific | A11035 | |
| Mouse anti human CD56-Alexa488 | BD Pharmingen | 557699 | |
| Mouse anti human CD146-PECy7 | BD Pharmingen | 562135 | |
| Mouse anti human CD45-PE-CF594 | BD Pharmingen | 562279 | |
| Mouse anti human CD34-APC | BD Pharmingen | 345804 | |
| Mouse anti human CD144-PE | BD Pharmingen | 560410 | |
| Alexa Fluor 488 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557702 | |
| PECy7 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 557872 | |
| PE-CF594 mouse IgG1k | BD Pharmingen | 562292 | |
| APC mouse IgG1k | BD Pharmingen | 550854 | |
| PE mouse IgG1k | BD Pharmingen | 556650 | |
| DAPI | Sigma | D9542 | CAUTION: toxic compound |
| Paraformaldehyde | Fluka | 762400 | |
| Fura-2 AM | ThermoFisher Scientific | F1201 | |
| Pluronic F-127 | ThermoFisher Scientific | P3000MP | |
| Thapsigargin | Sigma | T9033 | CAUTION : toxic compound |
| Ratio imaging acquisition software: Metafluor 6.3 | Molecular Device | ||
| * : MF 20 was deposited to the DSHB by Fischman, D.A. | |||
References
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